Теория и практика имуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
• В соответствии с вышеизложенным за основу классификация всех методов ИФА (а в более общем случае любого иммунохимического анализа с мечеными соединениями) следует принять разделение концентрации специфических комплексов анализируемого соединения с центрами связывания — прямое его определение (тип I) или нахождение по разности общего числа мест связывания и числа оставшихся свободными центров связывания (тип II, схема 4.1).
Классификация методов ИФА может быть осуществлена также по типу реагентов, используемых на первой стадии анализа. Если на первой стадии в системе присутствуют только анализируемое соединение и соответствующие ему центры связывания (антиген и специфические антитела), то метод является неконкурентным.
Для неконкурентного анализа типа I оптимальным является соотношение компонентов, при котором концентрация центров связывания значительно превышает концентрацию определяемого соединения. Действительно, в этом случае при повышении концентрации центров связывания равновесие в системе (схема 4.1) будет смещаться в сторону образования иммунохимических комплексов, концентрация комплексов возрастает, а следовательно, прямое оп-
80
рёделение концентрации комплексом можно осуществлять с лучшей чувствительностью и точностью.
^Необходимым условием для неконкурентного анализа типа II является соблюдение соотношения избытка или сравнимой концентрации определяемого соединения (Аг) и мест специфического связывания, так как в этом случае определяется разность общего числа мест связывания и числа образовавшихся иммунных комплексов. Если концентрация иммунных комплексов мала по сравнению с общим числом возможных мест связывания, то она будет определяться как разность двух близких чисел, каждое из которых находится с определенной ошибкой и потому не имеет достаточную точность.
Если на первой стадии анализа в системе одновременно присутствует анализируемое соединение и его аналог (меченное ферментом анализируемое соединение или анализируемое соединение, иммобилизованное на твердой фазе), конкурирующие за имеющиеся в относительном недостатке центры специфического связывания, то метод является конкурентным. Необходимым условием конкурентного метода является недостаток центров специфического связывания по отношению к суммарной концентрации анализируемого соединения и его аналога, так как в противном случае каждый из процессов образования иммунокомплексов может происходить независимо от другого, а следовательно, определяемая экспериментально концентрация метки не будет зависеть от концентрации анализируемого соединения в растворе.
Следующим принципом классификации методов ИФА является их разделение по типу проводимых на каждой из иммунохими-ческих стадий реакций. В соответствии с этим все методы можно разделить на две группы — гомогенные и гетерогенные. Если в ходе выполнения анализа все реакции, включая ферментативную стадию, протекают в растворе, то метод является гомогенным. В нем отсутствует стадия разделения образующихся иммунохими-ческих комплексов от свободных, не вступивших в реакцию компонентов. Определение концентрации исследуемого соединения основано на эффекте изменения каталитической активности фермента-метки,- возникающем при комплексообразовании с исследуемым лигандом или центрами специфического связывания.
Гетерогенный ИФА объединяет методы, в которых анализ проводится в двухфазной системе, при этом разделение на фазы может происходить на любой стадии определения. Гетерогенные методы включают обязательную стадию разделения свободного и образовавшего специфический комплекс меченого соединения, которые находятся в разных фазах*.
* Известны работы, которые можно отнести к безраздельным гетерогенным методам, основанным на эффектах сближения меченного ферментом соединения и специфического иммунокомплекса на твердой фазе. Подробнее они будут рассмотрены ниже,
81
К гетерогенным относятся методы, в которых разделение свободного и связанного в иммунохимический комплекс меченого реагента осуществляется как с помощью твердой фазы с иммобилизов]ан-ным реагентом, так и путем осаждения иммунокомплексов, осуществляемого введением в систему дополнительных растворимых компонентов (соли, полиэтиленгликоль, спирт, вторичные антитела, белок А и др.). Однако мы не будем останавливаться на рассмотрении всех этих подходов, а ограничимся только методами, в которых для разделения меченых компонентов используют твердую фазу с иммобилизованными на ней антителами или антигеном, так как в настоящее время они являются наиболее распространенными.
В целях удобства классификации целесообразно проводить разделение гетерогенных методов по характеру проведения первой стадии «узнавания», которая является определяющей для всего анализа. Если на первой стадии антиген или антитело используют в иммобилизованном состоянии, а следовательно, формирование специфического иммунокомплекса проходит на твердой фазе, то метод относится к твердофазным (англ. solid phase assay). Если же на первой стадии анализа образование специфических иммунных комплексов происходит в растворе, а лишь затем для целей разделения используют твердую фазу с иммобилизованным реагентом, то такие методы целесообразно классифицировать как гомогенно-гете-рогенные.
