Теория и практика имуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
Все методы, позволяющие определять концентрации свободного и связанного антигена, можно условно разбить на две большие
41
группы. К первой относятся методы, в которых стадия разделения свободного и связанного антигена осуществляется путем избирательного осаждения, аффинного связывания (иммобилизации) или гельфильтрации. Если реагенты достаточно сильно различаются своими молекулярными массами и размерами, то процедура разделения существенно упрощается. В случае корпускулярных антигенов оставшиеся несвязанные антитела могут быть отделены либо центрифугированием, либо пропусканием смеси через фильтр, задерживающий антиген. Для низкомолекулярных антигенов (гаптенов) используется равновесный диализ.
Вторая группа включает методы, базирующиеся на изменении физико-химических свойств антигенов (или меток, связанных с антигеном) при комплексообразовании с антителами: тушении или усилении флуоресценции, изменении степени поляризации флуоресценции, ингибировании ферментативной активности.
Равновесный диализ — наиболее распространенный метод изучения реакции антиген — антитело. Метод основан на различной способности антител и гаптена проходить через полупроницаемые мембраны. Раствор каждого реагента известной концентрации в одном и том же растворителе с одинаковой ионной силой и значением pH помещают по разные стороны мембраны. Молекулы гаптена диффундируют в раствор антител и связываются с ними. При достижении равновесия концентрация свободного гаптена выравнивается по обе стороны мембраны. Измерив равновесную концентрацию гаптена, можно рассчитать количество гаптена, связанного с антителами, и определить по уравнению (3.3) константу связывания.
• Как правило, метод равновесного диализа применяется для низкомолекулярных соединений (гаптенов) с ЛГГ<;3000. Это обстоятельство существенно ограничивает область использования метода. К недостаткам метода надо также отнести относительно большое время достижения равновесия (более 24 ч) и необходимость учета эффектов, вызываемых присутствием мембраны (неспецифическая адсорбция реагентов на поверхности мембраны), в результате чего необходимо работать с достаточно высокими концентрациями реагентов, что значительно понижает чувствительность определения константы связывания.
Методы фракционного осаждения используются для разделения комплексов антиген — антитело и несвязавшегося антигена. Они основаны на способности высокомолекулярных комплексов антиген—антитело избирательно осаждаться различными реагентами (полиэтиленгликолем, сульфатом аммония, этанолом, вторичными антителами). При установлении в системе равновесия осаждающий реагент добавляют в такой концентрации, при которой комплекс антиген—антитело и несвязавшиеся антитела становятся нерастворимыми и выпадают в осадок, который легко может быть удален центрифугированием.
42
Методы, не включающие фазовое разделение вступившего и не вступившего в реакцию антигена, относятся к группе гомогенных методов.
Флуоресцентные методы основаны на способности остатков триптофана в молекулах белков флуоресцировать (330—360 нм) при возбуждении УФ светом (280 нм). Взаимодействие ряда антигенов с антителами приводит к изменению интенсивности флуоресценции, что может быть использовано для оценки количе-
Таблица 2.1. Методы определения аффинности антител
Методы Используемые антигены
Равновесный диализ Осаждение глобулнновой фракции сульфатом аммония Осажденне углем, модифицированным декстраном Осаждение антиглобулииами Гельфнльтрация, разделение по молекулярной массе Тушение флуоресценции Усиление флуоресценции Поляризация флуоресценции Спектральные методы Тушение биолюминесценции Гаптены, диализуемые антигены Гаптены, антигены, растворимые прн 50%-ном насыщении сульфатом аммоння Г аптены Гаптены, белкн, полисахариды Гаптены, белковые полисахариды Гаптены н антигены со специфическими флуоресцентными свойствами Г аптены, белкн Гаптены, белки Гаптены, связанные с красителем Гаптены, белки
ства антигена, вступившего в реакцию с антителами. В зависимости от химической структуры антигена (или гаптена) может •наблюдаться как усиление, так и гашение флуоресценции. Степень гашения (или усиления) интенсивности свечения зависит от концентрации активных центров антител, константы их ассоциации с антигеном и пропорциональна концентрации образовавшихся специфических комплексов. Методы флуоресценции просты, не занимают много времени (10—20 мин) и имеют высокую чувствительность, что сокращает расход реагентов.
Метод деполяризации флуоресценции основан на измерении поляризации флуоресценции антигена, меченного красителем, до взаимодействия с антителами и после комплексообразования. Поляризация флуоресценции определяется молекулярным объемом частицы и степенью ее асимметрии. Комплексообразование антигена с антителом сопровождается резким изменением поляризации флуоресценции красителя (например, дансила), который играт роль метки антигена или антитела. Предел обнаружения антигена этими методами достаточно мал (10-9—10-10 М).
• Недостатками методов, основанных на измерении флуоресценции, являются необходимость работы с препаратами очищенных
