Теория и практика имуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
к0~36 к0-26 к0-6 Ка К{6 Ка+2б К0+Зб
Рис. 8. Графическое представление функции Гаусса
нормальное распределение,
/(*>
I
е
в У ‘2л
2а»
(3.10)
где стандартное отклонение
Г~
? (Кг 1=1
?Ко)*
характеризует гетерогенность антител (рис. 8).
В иммунохимии распределение антител по константам часто описывают одним из приближений нормального распределения, предложенного Сипсом. Приближение Сипса отклоняется от нормального при Ко±о, и значительные отклонения наблюдаются при Ко±2о. Широкое распространение этой функции для описания распределения антител по константам связывания обусловлено его сходством с обычно используемыми простыми методами обработки результатов иммунохимических равновесий.
Функция Сипса применительно к взаимодействию антигена с антителом валентности п позволяет получить соотношение
[Аг-Ат] _
п [Ат]0
(*р[Аг])°
1+(*0[Аг])а
(3.11)
39
где Ко — средняя аффинность; а — индекс гетерогенности (О^а^ ^1, гомогенность соответствует а=1).
Распределение Сипса является симметричным и унимодальным и может быть полностью охарактеризовано средней константой аффинности Ко и индексом гетерогенности «а». Произвольное предположение о симметричном распределении антител по аффинности имеет свои ограничения. Истинная форма распределения остается неизвестной. Часто все же на практике используют распределение Сипса для описания гетерогенной популяции антител. В действительности распределение антител по К бывает несимметричным и мультимодальным, поэтому, строго говоря, распределение антител по аффинности нельзя аппроксимировать распределением Сипса.
В частности, например, описаны распределения, сильно смещенные в сторону антител с низкой аффинностью. Вследствие этого представление всей популяции антител как популяции, взаимодействующей с одной средней аффинностью (/Со) или даже как бимодальной (Ко высокоаффинная и Ко'—низкоаффинная), не всегда точно отражает распределение антител по аффинности.
В предположении об отсутствии внутри- и межмолекулярных взаимодействий Муккур с сотрудниками ввели понятие об общей константе аффинности Kt, представляющей собой сумму произведений равновесных констант каждой из m субпопуляций антител на множители, учитывающие концентрационный вклад каждой из фракций в общей популяции антител:
v ... 1АТ/]0/</ v' [АтДоК/ /о iov
'-1 2 [Ат,]0 •
/=1
т. е. общая константа аффинности для гетерогенной популяции является средневесовым параметром и представляет собой сумму средневесовых аффинностей /n-субпопуляций в реакционной смеси. Концентрацию антигена, связанного в комплексы с антителами, можно представить в виде
B=V [АгАТ|]= *l[Ar] [ATJ0+ *'2[Аг].....[Ат2]0 + ...
А1 11 1+К, ГАг1 1 ШТ1 +/С,ГАг1 1 2J0T
1-1 Km [Аг]
1 + Km [Аг]
1 н- /Cl 1Аг] 1 "и 1 1+/С2[Аг]
?IAtJo. (3.13)
Можно показать, что предельное значение функции Q({Ar]), являющейся формальным выражением для константы равновесия,
Q =----(3.14)
([Ат]0 — В) [Аг] А '
40
При концентрации [Аг]->-0 приближается к Kt'-
lim Q=Kt- (3.15)
[Аг]->-0
Для гетерогенной популяции антител Q зависит от равновесной концентрации [Аг] в системе, а графически зависимость lgQ от [Аг] имеет вид кривой с отрицательным наклоном. Экстраполируя экспериментальную зависимость lgQ от [Аг] к нулевой концентрации [Аг]=0, можно получить предельное значение Q’, равное Kt. Для гомогенной популяции Q) не зависит от [Аг] и представляет собой истинную константу связывания Ко-
§ 3. Методы определения аффинности антител
Определение аффинности (или константы связывания) антител в сыворотке или выделенных в очищенном виде представляет собой сложную экспериментальную и теоретическую задачу. Трудности обусловлены следующими обстоятельствами.
Во-первых, гетерогенностью антител по физико-химическим свойствам, в том числе по сродству к антигену. Во-вторых, сложностью определения общего количества антител, а также отдельных фракций. В-третьих, в случае поливалентных антигенов возможностью образования комплексов сложного состава, в том числе циклической структуры, в которых проявляется кооператив-ность взаимодействия активных центров антител. Все это не позволяет применить традиционные методы для расчета истинных значений констант связывания. Более надежные данные могут быть получены для моноклональных антител и их Fab-фрагментов, так как в этом случае могут быть выделены индивидуальные антитела в гомогенном виде.
Истинные значения констант связывания важны для определения термодинамических характеристик процесса взаимодействия-антиген— антитело. Для практических целей, в частности для разработки методов иммуноферментного анализа, достаточно знать эффективные значения, характеризующие свойства используемых антител.
Рассмотрим принципиальные подходы к определению констант равновесия. Из уравнения (3.3) следует, что для расчетов необходимо знать концентрации свободного и связанного с антителами антигена в условиях равновесия. Обычно для этого используют антигены, меченные маркером, который с высокой чувсти-тельиостью может быть определен одним из доступных физикохимических методов.
