Теория и практика имуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
36
ВИЯ характеризуются антитела против углеводов (Ка< 10е— 10® л/моль).
Щ Таким образом, количественно специфичность можно оценить, измеряя изменение свободной энергии связывания или внутреннюю аффинность. В практических целях иногда очень важно провести сравнение специфичности взаимодействия ряда антигенов с антителами, индуцированными одним из этих антигенов. Относительная специфичность в этих случаях может быть выражена как отношение внутренних аффинностей взаимодействия с антителами рассматриваемого антигена и антигена, индуцировавшего антитела.
Подобного рода проблемы очень часто возникают, например, при разработке методов иммуноферментного анализа лекарственных препаратов, стероидных и белковых гормонов. В зависимости от способа получения антисыворотки антитела могут быть специфичны либо только к одному лекарственному препарату (гап-тену), либо к целой группе близких по структуре химических соединений. В этих случаях распространен способ оценки специфичности, основанный на сравнении связывания антител в данной концентрации (или в определенном разведении иммунной сыворотки) одного и того же количества гомологичного и гетердлогичного гап-тена. При этом концентрация образовавшегося иммунного комплекса для гомологичного гаптена принимается равной единице, а связывание всех гетерологичных гаптенов оценивается как доля от соответствующего связывания гомологичного гаптена.
Представляет большой интерес и оценка специфичности различных популяций антител, например различных типов моноклональных антител, продуцируемых разными клонами клеток. Такое сравнение может быть проведено на основании сопоставления значений внутренней аффинности: антитела с более высокой специфичностью характеризуются более высоким значением константы внутренней аффинности.
§ 2. Взаимодействие антигена с субпопуляцией антител
Ранее для количественного описания эффективности взаимодействия антиген — антитело за основу была взята простая модель взаимодействия одновалентного антигена и одновалентного антитела. Но так как молекула антитела имеет несколько антигенсвязывающих центров и, кроме того, способна взаимодействовать с несколькими антигенными детерминантами молекулы антигена, то такая характеристика образования иммуно-химического комплекса является весьма упрощенной.
Для описания более сложного реально существующего процесса взаимодействия поливалентного антитела с поливалентным ан-
37
тигеном введен термин авидность, или функциональная аффинность (функциональное сродство). В этом случае простые моновалентные взаимодействия характеризуются «внутренним сродством», или «внутренней аффинностью». С биологической точки зрения именно функциональная аффинность играет основную роль в иммунном ответе на инфицирование организма вирусами или бактериями, имеющими на своей поверхности повторяющиеся антигенные детерминанты.
Процесс образования комплекса антиген — антитело состава 1 :1, в котором реализуются поливалентные взаимодействия, также является обратимым и может быть охарактеризован константой комплексообразования. С энергетической точки зрения образование поливалентного комплекса намного выгоднее, чем моновалентного. Напрймер, было показано, что IgG-антитела с внутренней аффинностью к 2,4-динитрофенольному (ДНФ) гаптену 107 л/моль имеют функциональную аффинность по отношению к комплексу ДНФ — фаг 4-174—1010 л/моль, т. е. бивалентные взаимодействия являются в 1000 раз более прочными, чем моновалентные.
Ранее полагалось, что присутствующие в системе антитела характеризуются одинаковой константой ассоциации с антигеном или же одинаковой энергией связывания. В качестве такой субпопуляции может выступать субпопуляция антител, продуцируемых одним клоном антителпродуцирующих клеток,— моноклональные антитела.
Синтезируемые в живом организме антитела гетерогенны по физико-химическим свойствам. Общая популяция антител иммунной сыворотки включает в себя антитела с различными значениями изменения свободной энергии взаимодействия с гаптеном, т. е. антитела различной аффинности. Схему взаимодействия- антигена с общей популяцией антител, представляющей совокупность субпопуляций, мож!ёт быть представлена в следующем виде:
Для общей характеристики такой популяции антител по аффинности взаимодействия с антигеном используют некоторое среднее значение аффинности Ко для л-го числа субпопуляций (методы расчета Ко приведены ниже). Как правило, истинная форма распределения антител по значениям констант взаимодействия неиз-
Ar-j-ATj^di^ Аг-Ат! Кх= Ar-f At2 Аг • Ат2 К2—
[Аг].[Ат2]
[ArMATj] ’ [Аг-Атд] .
[At-Atj]
(3.9)
38
рестна и обычно определяемая тем или иным способом равновесная константа взаимодействия является некоторым эффективным параметром.
При разработке методов иммунохимического анализа, базирующихся на реакции антиген — антитело, знание физико-химических характеристик специфических взаимодействий очень важно, поскольку позволяет оценить чувствительность и специфичность метода, осуществить правильный подбор реагентов для анализа.
Так как образуемые в ответ на введение в организм антитела являются гетерогенными по константам связывания, средняя аффинность Ко— это, в действительности, некоторое среднее значение для неизвестного распределения частных констант Kt (1 ^ t ^ п), где число п — неизвестно. Для характеристики получаемой антисыворотки . целесообразно ввести некоторую функцию распределения антител по аффинности. Простейшее приближение описываемое функцией Гаусса:
