Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.
Скачать (прямая ссылка):
вносят 2,7 мл физиологического раствора и 0,3 мл исследуемой
неразведенной сыворотки. После перемешивания повторным втягиванием в
пипетку из первой пробирки отбирают 2 мл и вносят в последнюю и во вторую
побирки, из второй в третью и так до предпоследней, в которой остается
только физиологический раствор.
В качестве антигена используют взвесь фрагментов мицелия и спор грибов в
физиологическом растворе, профильтрованную через трехслойный стерильный
марлевый фильтр. Густота взвеси 100 млн. клеток/мл, убитых прогреванием в
водяной бане при 70° С в течение 2 ч или карболизированных 25%-ным
раствором фенола.
Антиген вносят пастеровской пипеткой в соответствующие пробирки с
разведенной сывороткой по 3-4 капли (кроме последней, контрольной).
Контрольными служат первая пробирка, не содержащая сыворотки, и последняя
- с сывороткой, не содержащей антиген.
Набор пробирок в штативе тщательно встряхивают, помещают на 2 ч в
термостат, после чего выдерживают в течение 18-20 ч при комнатной
температуре или в холодильнике при 4-5° С. Результаты реакции учитывают
через сутки, сравнивая их с контрольными пробирками. В первой контрольной
пробирке, где отсутствует сыворотка, жидкость должна быть гомогенной,
мутной, не содержать ни хлопьев, ни зерен. Во второй пробирке (без
антигена) жидкость должна быть прозрачной. При наличии хлопьев в мутной
жидкости реакция оценивается как положительная (2+); при сохранении
исходной гомогенной мути реакция считается отрицательной. Титр реакции
определяется разведением сыворотки в последней пробирке, где реакция
имеет оценку не менее чем 2 "г •
Реакцию агглютинации оценивают визуально, отмечая плюсами (от + до ++Н-[-
), или методом Сергиева. Для этого результат реакции, выраженный плюсами,
умножают на частное от деления степени разведения в данной пробирке на
степень разведения в первой. Например, в пятой пробирке сыворотка
разведена в 160 раз и результат реакции оценен ++++; разведение в первой
пробирке 1 : 10, тогда количественная оценка реакции агглютинации по
Сергиеву будет равна 4 • 160/10 - 64. Оценочный индекс в этом случае
выводят из суммы оценок реакций в каждой пробирке.
XVII.9.3. РЕАКЦИЯ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ
Для постановки реакции необходимо иметь эритроциты барана, им-М'унную и
нормальную сыворотки кроликов и специфический антиген из грибов.
Двухдневные эритроциты отмывают 2-3 раза вероналовым буфером, добавляют
0,1 мл осевших при отстаивании клеток к 4 мл полисахаридного антигена в
разведении 1 : 100 - 1 : 200, доведенного 0,1 н. раствором NaOH до pH
7,3. Смесь выдерживают при 37° С в течение 2 ч (встряхивают каждые 15-20
мин), затем центрифугируют при 1000-1500 об/мин; промывают
свежеприготовленным вероналовым буфером и вновь трижды центрифугируют,
после чего клетки заливают буфером до получения 0,5% -ной суспензии.
407
Для удаления неспецифетческих к эритроцитам антител из сывороток к 1 мл
последних добавляют по 0,1 мл 0,5% -ной взвеси нормальных эритроцитов.
Смесь инкубируют в течение 10 мин при 37° С с последующим выдерживанием
при 4-6° в течение 4-5 ч. Клетки отделяют центрифугированием при 1000-
1500 об/мин, а сыворотки разводят вероналовым буфером (1:2 - 1 : 8192;
двукратные разведения) и по 0,4 мл разливают в вассермановские пробирки.
Туда же добавляют по 0,4 мл сенсибилизированных эритроцитов. Пробирки
энергично встряхивают и оставляют при 37° С в течение 1,5-2 ч. Контролями
служат нормальные эритроциты и вероналовый буфер. При отрицательной
реакции эритроциты осаждаются на дно и компактно заполняют конусовидную
часть пробирки. При положительной реакции все дно пробирки покрыто рыхлым
слоем эритроцитов; после легкого встряхивания проявляется агглютинация в
виде крупных хлопьев, четко видных с помощью зеркала.
XVII.9.4. РЕАКЦИЯ КОЛЬЦЕПРЕЦИПИТАЦИИ
Двухкомпонентная реакция, для постановки которой нужны исследуемая
сыворотка и соответствующий антиген (полисахарид или ультразвуковой
дезинтеграт из грибов). Реакцию проводят в пробирках диаметром 0,75 см, в
которые вносят по 0,5 мл испытуемой сыворотки, затем осторожно по стенке
из пастеровской пипетки наслаивают раствор антигена (перемешивания
жидкости не допускается).
В положительных реакциях в зоне соприкосновения сыворотки и антигена
иногда сразу же образуется беловатое мутное кольцо из выпадающего
преципитата. При отсутствии кольца пробирки помещают в термостат при 37°
С на 2 ч. Реакция оценивается по степени разведения антигена (обычно
десятикратном, начиная с 1 : 100). Контролем служат аналогичные реакции с
тем же антигеном, в которых испытуемая сыворотка заменяется заведомо
отрицательной и физиологическим раствором. Кольцо при этом не образуется,
жидкости остаются прозрачными.
XVII.9.5. РЕАКЦИЯ ПРЕЦИПИТАЦИИ В АГАРОВОМ ГЕЛЕ
В последние годы широкое распространение получила реакция преципитации в
агаровом геле по Оухтерлони, для постановки которой требуется специально
обработанный агар, исследуемая сыворотка и специфический антиген, чаще
