Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.
Скачать (прямая ссылка):
для пены (12) и ловушки (5 и 6), заполненные соответственно растворами
фенола и щелочи, и далее через фильтр (7) поступает в атмосферу.
Необходимый температурный режим в ферментере поддерживают с помощью
ультратермостата (11),из которого подогретая вода поступает в емкость,
где находится ферментер.
Все коммуникации изготовлены из -силиконовых трубок; в местах
разветвления использованы стеклянные трубки различного диаметра. Систему
стерилизуют в два приема: сосуд для ферментации с питательной средой и
установленным на место барботером и коммуникации [319].
Для получения полноценных антигенов необходимо применять стандартные и
оптимальные питательные среды и условия выращивания. Антигены получают из
грибницы, отделенной от жидкой среды фильтрованием или соскобом
стерильной лопаткой, реже - смывом с поверхностных культур, выращенных на
плотных агаровых средах. Собранную в фарфоровую ступку грибную массу
растирают пестиком в физиологическом растворе до получения гомогенной
взвеси; разливают в колбочки, автоклавируют при 100-110° С в течение 10
мин или подогревают в течение одного часа при 70-80° на водяной бане.
XVII.10.1. МЕТОДЫ ПОЛУЧЕНИЯ ГРИБНЫХ АНТИГЕНОВ
И АЛЛЕРГЕНОВ
XVII.10.1.1. МЕТОД ПЛЯТО - НЕЙССЕРА
Самым старым методом получения аллергенов из патогенных мицелиальных
грибов является метод Плято - Нейссера, видоизмененный Блохом. Грибы
выращивают на жидкой среде Сабуро, содержащей 1% пептона и 4% мальтозы.
Через 3 мес роста при 26° С мицелий отделяют, помещают в стерильную
ступку и растирают замороженным снегом угольной кислоты со стерильным
песком (кизельгуром). После измельчения мицелия в ступку добавляют
культуральную жидкость до получения кашицеобразной массы и 0,25-0,5%-ный
раствор фенола. Грибную массу переносят в колбу, встряхивают в течение
часа, затем колбу ставят в термостат при 37° С на 24 ч. Жидкость
фильтруют через асбестовый фильтр или свечу Шамберлана. Фильтрат
разливают по ампулам и используют в качестве аллергена.
412
XVII.10.1.2. ПОЛУЧЕНИЕ АНТИГЕНОВ ПО БУАВЁНУ И МЁСРОБЕАНУ
Клетки грибов, выращенных на плотных или жидких питательных средах,
отмывают от среды физиологическим раствором при повторном (2-3-кратном)
взбалтывании и отстаивании или центрифугировании, подсушивают в
термостате до получения воздушно-сухой массы. Затем их заливают 0,5%-ным
раствором ТХУ в соотношении 10-20 частей кислоты на 1 часть клеток.
Хорошо размешанные клетки выдерживают в течение 12 ч при 4-5° С,
центрифугируют, жидкость сливают, подщелачивают 0,25%-ным раствором NaOH
до pH 7,2. После этого к жидкости прибавляют 3-4-кратный объем этилового
или метилового спирта до осаждения полисахарида, дающего положительную
реакцию Мо-лиша.
XVII. 10.1.3. ФЕНОЛЬНЫЙ МЕТОД КОНИКОВА
Микробные клетки, отмытые от питательной среды физиологическим раствором,
взбалтывают с небольшим количеством воды и осаждают тройным объемом
ацетона. Полученный осадок клеток промывают дважды ацетоном, а затем один
раз эфиром. Большая часть эфира удаляется из осадка свободным испарением,
а остальная - в вакуум-эксикаторе.
Навеску высушенных таким образом клеток помещают в фарфоровую ступку,
нагретую на водяной бане до 50-70° С. Пипеткой, также нагретой на пламени
спиртовки, набирают нужное количество предварительно расплавленного
фенола (из расчета 1 мл фенола на 1 г клеток), прибавляют к навеске
клеток гриба и растирают пестиком для получения однородной массы. Через
30-45 мин в ступку постепенно при растирании наливают подогретую до 50° С
дистиллированную воду в объеме, необходимом для получения 5%-ного
раствора фенола. Молочно-белую фенольную суспензию подвергают длительному
центрифугированию при 3000 об/мин и опалесцирующую надосадочную жидкость
декантируют или отсасывают пипеткой. Для удаления фенола экстракт
диализируют в проточной воде 48 ч (до исчезновения запаха фенола). При
наличии белков их удаляют, подкисляют диализат 0,1 н. раствором соляной
кислоты до pH 4-5. При этом белки выпадают в осадок, который
центрифугируют, а к надосадочной жидкости прибавляют 2-3 объема этилового
спирта или ацетона (лучше обезвоженных). Осадок полисахарида
центрифугируют, промывают спиртом и эфиром, высушивают и сохраняют долгое
время (без потери активности).
XVII.10.1.4. ПОЛУЧЕНИЕ АНТИГЕНОВ ПРИ ОБРАБОТКЕ КЛЕТОК
МОЧЕВИНОЙ [199]
Воздушно-сухую грибную массу в количестве 12,5 г смешивают с 750 мл 15%-
ного раствора химически чистой мочевины и нагревают в течение 9 ч при 38°
С при периодическом встряхивании. Смесь заливают толуолом, оставляют на
ночь при 4-5° С и центрифугируют. Жидкость диализируют под слоем толуола
для удаления мочевины, фильтруют через свечу, концентрируют в вакуум-
аппарате до небольшого объема. Полисахарид осаждают этиловым спиртом,
который добавляется в двойном или тройном количестве по отношению к
сгущеному экстракту. Осадок антигена центрифугируют, промывают спиртом и
эфиром, высушивают в вакуум-эксикаторе или при 37° С в термостате. В
