Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.
Скачать (прямая ссылка):
грибных культур на целлофане их выдерживают в течение 30 мин над парами
формалина, налитого на внутреннюю поверхность крышки от чашки Петри.
Целлофановые диски с культурами можно исследовать на предметном стекле в
спирте с глицерином, в синем лактофеноле. Для выявления аскоспор
исследуемые грибы засевают на среду Городковой, на кукурузный агар, 2%-
ный картофельный агар, 3%-ный (по Балингу) сусло-агар, морковь, а также
на гипсовые блоки или кусочки красного кирпича, не полностью погруженные
в стерильную водопроводную воду в чашках Петри.
Окраска аскоспор по Куферату. Препарат из взвеси культуры на предметном
стекле подсушивают и фиксируют на пламени спиртовой горелки. Через
фильтровальную бумагу окрашивают его в течение 2-3 мин карболовым
фуксином Циля при периодическом кипячении, избегая высыхания раствора
красителя. Препарат промывают водой, очищают края от фуксина, погружают в
спирт, подкисленный 1%-ной соляной или 2%-ной молочной кислотой, обильно
промывают водой, подкрашивают в течение 1 мин 1%-ным раствором
метиленового синего, снова промывают водой и во влажном состоянии
покрывают китайской тушью, каплю которой наносят пастеровской пипеткой в
центр мазка. Зрелые аскоспоры окрашиваются при этом в красный цвет, аски
выглядят белыми на черном фоне, вегетативные клетки принимают зеленовато-
синеватую окраску.
Окраска аскоспор по Виртцу в модификации Шеффера - Фултона. Мазок взвеси
исследуемых культур на стекле фиксируют на пламени, покрывают 5%-ным
водным раствором малахитового зеленого, подогревают в парах на спиртовке
и оставляют на 5-6 мин, 30 с промывают проточной водой и исследуют под
иммерсией. Аскоспоры окрашиваются в зеленый, клетки грибов в красноватый
цвет. Образование хламидоспор изучают на рисовом или морковно-
картофельном агаре.
Для выделения ростковых трубок, свойственных Candida albicans, в свежую
человеческую сыворотку (0,5 мл в пробирке) вносят несколько капель взвеси
исследуемых грибов. Посевы выдерживают в термостате при 37° С в течение
часа и исследуют без окраски в нативных препаратах при большом увеличении
микроскопа.
Образование пигмента удобнее наблюдать при выращивании грибов в широких
пробирках (18 X 150 мм), закрытых ватными пробками. Ограничение притока
атмосферного кислорода приводит к потере пиг-ментообразования.
Совершенные формы дерматофитов выделяют из почвы с помощью фрагментов
стерильных детских или конских волос в качестве приманки. Клейстотеции в
виде беловатых мучнистых зерен появляются на 20- 30-й день при 20-25° С.
Музейные фиксированные культуры грибов на агаровых блоках. Из зрелой
культуры гриба прокаленным скальпелем или лопаточкой
399
вырезают агаровый блок с отдельной колонией. Он должен быть довольно
тонким, освобожденным от избытка агаровой среды, размером немного меньше
покровного стекла. Блок помещают верхней поверхностью на покровное стекло
и покрывают каплей 10%-ного раствора формалина. После того как формалин
диффундирует в агар, излишек его удаляют фильтровальной бумагой и блок
вместе с покровным стеклом переносят на предметное стекло. Пространство
между стеклами заполняют монтирующей жидкостью (лактофенол, смесь этанола
с глицерином), края заливают подогретым парафином. Препараты пригодны для
наблюдёнйя в течение 2-3 лет.
XVII.7. ИЗУЧЕНИЕ МОРФОЛОГИИ И БИОЛОГИИ ПАТОГЕННЫХ ГРИБОВ
XVII.7.1. ИЗУЧЕНИЕ МОРФОЛОГИИ
При характеристике культур патогенных грибов следует учитывать морфологию
колонии и ее патогенность для животных. Необходимо также учитывать
скорость и особенности развития грибов в культурах, возрастной
полиморфизм, макро- и микроскопические признаки, появление секторов,
вторичных и дочерних колоний, плеоморфных и фа-виформных (строчковидных)
изменений. При морфологической характеристике различных клеточных форм в
культурах патогенных грибов учитывают размеры, форму, расположение и
происхождение различных клеток, что существенно для идентификации гриба.
Для микроскопического изучения культуры лопаточкой берут небольшой
круговой сектор колонии. В более старой, центральной зоне колонии
преобладают крупные, богатые липидами хламидоспоры; в средних зонах -
обильные макро- и микроконидии, артроспоры; в молодой периферической зоне
- интенсивно ветвящиеся нити мицелия. Сравнительное изучение клеточных
форм в разных участках одного сектора позволяет судить о возрастной
изменчивости культуры, интенсивности спорообразования, наличии
характерных видовых при-внаков [200].
XVII.7.2. ИЗУЧЕНИЕ БИОХИМИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ
Биохимическую активность культур грибов оценивают по их способности к
усвоению (ауксанограмма) и ферментации (зимограмма) азотистых веществ и
углеводов. В качестве основной ферментационной среды используют 1%-ную
дрожжевую или пептонную воду с добавлением 2% соответствующих углеводов и
индикатора кислотообразова-ния. Показателем брожения является покраснение
жидкой среды (кис-лотообразование) и выделение углекислоты. Для
