Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.
Скачать (прямая ссылка):
ч помещают в термостат для прорастания клеточных элементов ("освежение").
Затем берут стерильное предметное стекло с 4-5 каплями совершенно
прозрачного сусло-желатина и в первую каплю вносят крупную петлю взвеси
"освеженных" грибов на жидком сусле в пробирке. Из первой капли материал
переносят в остальные, энергично размешивая их платиновой петлей,
прожигаемой перед переносом материала в новую каплю. Материал из
последних разведений кладут на стерильные покровные стекла, помещая
капельки над углублением предметного стекла, и исследуют их под
микроскопом. Каплю с одной клеткой отмечают, покровное стекло обмазывают
вазелином и ставят в термостат для выращивания. Из "одноклеточной"
колонии в дальнейшем делают высевы на плотные среды для получения чистых
культур гриба.
Метод Топачио. Готовят целлофановые листочки размером 20 X X 50 мм
(несколько меньше обыкновенного предметного стекла), стерилизуют их в
автоклаве или погружением на 10-20 ч в 96%-ный этанол. Приклеивают
листочки к стерильному предметному стеклу агар-агаром или желатином,
прокатывая по нему стерильную стеклянную палочку для создания равномерной
поверхности. Затем на целлофановый листочек тонкой стеклянной палочкой с
небольшим расширением на конце наносят два ряда маленьких капель взвеси
гриба густотой
3-5 клеток в каждой. Быстро просматривают капли при малом увеличении
микроскопа и там, где находят одну клетку, наносят небольшую каплю жидкой
питательной среды для предохранения от высыхания. Затем тонким и острым
скальпелем вырезают квадратик целлофана с этой каплей, из которой в
дальнейшем обычным путем получают культуру на плотных средах [200].
XVII.6. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ПАТОГЕННЫХ ГРИБОВ
В процессе культивирования грибов необходимо строгое соблюдение
постоянных условий: температуры и влажности, степени освещения
(темнота!), свежести питательных сред, их кислотности [201, 401] (см.
приложение 7),
897
XVII.6.1. МЕТОД КУЛЬТИВИРОВАНИЯ В ВИСЯЧЕЙ КАПЛЕ
На покровное стекло асептично наносят большую каплю жидкой питательной
среды и кладут в нее маленький комочек культуры. Каплю подвешивают над
стеклянным кольцом высотой 16, шириной 10, толщиной 3 мм, прикрепленным к
предметному стеклу расплавленным парафином. Кольцо ставят во влажную
камеру, помещают в термостат (25-30° С) и ежедневно наблюдают за
развитием гриба. Вместо кольца используют стерильные предметные стекла с
углублением.
XVII.6.2. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ НА ПРЕДМЕТНЫХ СТЕКЛАХ ПО РИВАЛЬЕ И ЗЕЙДЕЛЮ
Небольшой комочек культуры гриба высевают на предметное стекло, смоченное
толстым слоем агаровой среды, и выращивают во влажной камере при 25-35°
С. Через разные сроки, по мере надобности, их подсушивают в течение суток
при 37° С, препаровальной иглой снимают центральный бугорок культуры и
погружают препарат в раствор коллодия (коллодий - 1 ч, безводный этанол -
2 ч, серный эфир -2 ч) и после быстрого стекания жидкости препарат
оставляют мазком вниз на 24 ч при комнатной температуре или при 25° С в
термостате для фиксирования мицелия и спор.
XVII.6.3. ВЫРАЩИВАНИЕ ГРИБОВ В ТОНКОМ СЛОЕ АГАРА НА СТЕКЛЕ
На стерильные предметные стекла наносят 3-5 капель расплавленной агаровой
среды, дают агару равномерно распределиться по поверхности стекла и
быстро поворачивают агаровым слоем вниз. После уплотнения агара в том же
положении стекол делают тонкий штриховой посев гриба через всю
поверхность агаровой среды. Стекла помещают на стеклянные трубочки,
лежащие на дне стерильных чашек Петри во влажной камере посевом вниз.
Препараты исследуют через день в сухой системе микроскопа, идентифицируя
грибы по развитию мицелия и споруляции.
Для постоянного наблюдения за ростом грибов на стеклах и в висячих каплях
используют специальные столики для микроскопа с электрическим нагревом,
что позволяет изучать развитие грибов при разных температурах.
XVII.6.4. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ГРИБОВ НА АГАРОВЫХ БЛОКАХ
Небольшой блок агаровой среды размером 10 X 10 X 3 мм асептично кладут на
середину стерильного предметного стекла, засевают небольшим комочком или
взвесью исследуемой культуры, покрывают стерильным покровным стеклом и
выращивают во влажной камере. Нити гриба развиваются на агаровом блоке и
на стеклах вокруг блока. После удаления агарового блока мицелиальный
налет на стекле фиксируют 96%-ным этанолом, высушивают, покрывают
подкрашенным синью лактофенолом. Затем покровное стекло кладут на
предметное пре-
898
паратом вниз, а предметное покрывают чистым покровным стеклом, края
стекол обмазывают лаком или растопленным парафином и исследуют обычным
путем [149].
XVII.6.5. ДРУГИЕ МЕТОДЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ
Окраска по Кондо -- Шоу. Стерильные целлофановые диски перед
употреблением смачивают стерильной дистиллированной водой и асептично
накладывают на поверхность агаровой среды в чашки Петри. Чашки
выдерживают в течение 48 ч в термостате для выявления возможного
загрязнения, после чего засевают изучаемым грибом. Для обезвреживания
