Культура ткани в вирусологических исследованиях - Анджапаридзе О.Г.
Скачать (прямая ссылка):
самым повлиять на форму и размеры бляшек, а во-вторых, выживаемость клеток иод агаром тем лучше, чем больше число клеток. Нередко наблюдаемый лизис части клеток во флаконах через 24 часа после внесения покрытия бывает связан с указанной выше причиной. В ряде случаев гибель клеток обусловлена токсичностью плохо обработанного стекла (при этом зоны лизиса чаще располагаются у горлышка сосудов, где труднее всего обработать стекло). В наших экспериментах хорошие результаты получились при использовании чашек Карреля или Петри, изготовленных из обычного лабораторного стекла.
В большинстве опубликованных работ указывается, что в состав покрытия вводили агар Дифко. Первоначально этот агар рекомендовали подвергать специальной, довольно сложной очистке. Однако Сюн и Мельник (1955) сообщили, что при опытах с клетками почек обезьян можно использовать неотмытый агар. В повседневной работе мы с успехом применяли неочищенный агар Дифко для получения колоний вируса полиомиелита в культурах клеток HeLa, Нер-2 и СОЦ. Как показали исследования С. Г. Дзагурова, Г. А. Сафоновой, Г. А. Ивановой, Г. А. Шмелевой (1960) импортный агар может быть заменен отечественными препаратами. Однако в этом -случае необходимо обработать агар для удаления токсических продуктов. Рекомендуют 50 г агара измельчить на кусочки величиной не более 0,5 смг, поместить в бутыль и залить 3 л дистиллированной воды. Через 3 часа воду следует слить и добавить 3 л свежей дистиллированной воды. В течение 3 дней ежедневно сменять воду в бутылях (экстракция происходит при комнатной температуре). Затем агар освобождают от избытка влаги — отжимают через марлю, после чего к агару добавляют 3 л ацетона. Через 3 часа ацетон заменяют новой порцией и бутыль оставляют на 20 часов при комнатной температуре. В заключение агар на 6 часов помещают в дистиллированную воду, отжимают через марлю и сушат при 37° или под электрическими лампами. Очищенный агар следует использовать в концентрации 1 : 100. Такая концентрация создает достаточную прозрачность покрытия, что позволяет без затруднений подсчитывать колонии вируса.
Хорошие результаты при использовании отмытого отечественного агара были получены JI. Г. Степановой в опытах со штаммом Брунден (табл. 24),
Были проведены опыты, чтобы выяснить возможность применения отечественных образцов нейтрального красного при титровании вирусов методом бляшек. Во всех опытах при использовании препаратов фирмы Дифко и образцов, изготовляемых нашими заводами, получались одинаковые результаты.
Установлено, что отечественный нейтральный красный не обладает токсическим действием на клетки почек обезьян.
Работами многих исследователей установлено, что присутствие нейтрального красного в покрытии является не безразлич-
ным для клеток и нередко может служить источником серьезных ошибок. По данным Дарнелла,- Локкарта и Сойера (Darnell, Lockart, Sawyer. 1958), нейтральный красный на 34—55% снижает образование бляшек вируса полиомиелита в клетках HeLa и на 55—89% уменьшает количество отдельных колоний вируса лошадиного энцефаломиелита в культурах куриных фибробластов. В опытах с вирусом везикулярного стоматита отмечено, что в присутствии нейтрального красного образуется только 30—66% бляшек по сравнению с количеством, которое определяют в случаях, когда краску добавляют через 24—36 часов после заражения (Макклейн, Хаккет, 1958).
Таблица 24
Влияние различных сортов агара на образование бляшек вируса полиомиелита в культуре клеток почечного эпителия обезьян
Ara(i Число Контроль
Бляшек1
Дифко 1,5 % 2 80 Клетки без изме
нений
Отечественный
1,5^з..... 83 Клетки без изме
нений
1 Матрасы заражены штаммом Брунден в разведении 10—3,
2 Агар не отмывали.
3 Агар отмывали.
Грин и Оптон (Green, Opton, 1959) показали, что нейтральный красный обладает выраженным фотодинамическим действием, в результате которого происходит разрушение культур Нер-2, клеток почечного эпителия цыпленка, собаки, обезьяны. В клетках, сохранивших свою морфологическую целость после воздействия нейтрального красного, образуется меньшее число бляшек по сравнению с контролем.
С Многие исследователи рекомендуют на зараженные культуры / наносить покрытие без нейтрального красного, а окраску клеток для выявления бляшек проводить за несколько часов до учета результатов. Нейтральный красный прибавляют в виде раствора, приготовленного в фосфатном буфере, в растворе Эрла или в агаровом покрытии, которое наносят поверх первого слоя агара [Дарнелл, Локарт, Сойер, 1958; Фох, Лунд, 1955; Дюбес (Dubes, 1956)]. После внесения красителя культуры помещают в термостат на 2—5 часов или, что реже, на одну ночь.
Необходимо отметить, что в некоторых случаях можно наблюдать образование бляшек в культурах без покрытия. Это в первую очередь относится к вирусам, для цитопатогенного действия которых характерен очаговый тип поражений.
