Культура ткани в вирусологических исследованиях - Анджапаридзе О.Г.
Скачать (прямая ссылка):
Среду иного состава (среда Крета) использовали Лейффлер и Хэссиг {Loffler, Hassig) при титровании в цветной реакции антител к вирусам полиомиелита в сыворотках людей. В дальнейшем Леффлер и Фогт (Lofller, Vogt, 1957) разработали микрометод для определения полиомиелитных антител в сыворотках человека. Для получения сыворотки каплю крови, выступающую после укола мякоти пальца, набирали в специальные стеклянные капилляры. После заполнения кровью концы трубочек запаивали и в таком виде доставляли в лабораторию. Капилляры центрифугировали в течение 10 минут при 2500 об/мин. затем надпиливали их на границе между осадком эритроцитов и сывороткой и до постановки опыта помещали в шкаф с низкой температурой. Опыт ставили на пластмассовых досках с микролунками. Сыворотку из трубочки выливали в первую лунку. Микропипеткой набирали нужный объем сыворотки и переносили его в следующую лунку для приготовления нужного разведеиия. К 0,04 мл сыворотке добавляли такой же объем рабочего разведения вируса и 0,04 мл взвеси клеток (100 000 клеток в 1 мл), а затем наслаивали 0,1 мл вазелинового масла. Результаты учитывали на 3—4-й день.
Авторы считают, что уменьшение объема реагентов не отражается на точности результатов исследования. При определении антител в крови ко всем трем типам вируса с помощью предложенного микрометода достаточно 0,05 мл сыворотки. В то же время резко снижается расход клеток и сред по сравнению с общепринятой методикой постановки цветной реакции.
Простую среду для постановки цветной пробы использовала Л. Г. Степанова (1959). Она показала, что четкие результаты получаются при работе с 0,5% раствором гидролизата лактальбумина, содержащим 2% нормальной телячьей сыворотки (pH 7,8). Ею отмечено также, что для постановки цветной реакции пригодны линии перевиваемых клеток СОЦ и Нер-2 (табл. 21).
В опытах сравнительного титрования вируса полиомиелита I типа (штамм Брунден) Л. Г. Степановой было установлено, что клетки HeLa обладают относительно низкой чувствительностью (титр 104—105 ТЦД60/мл). Более высокие титры получены при использовании для цветной пробы почечных клеток макаки резус
(106-5 — 107,E ТЦДео/мл) и перевиваемой линии клеток СОЦ
(106-5 — 107’5 ТЦД50/МЛ). При титровании на клетках Нер-2 были
получены максимальные титры (107—108). Результаты исследований Л. Г. Степановой представлены в табл. 21.
Таблица 21
Титрование вируса полиомиелита 1 типа (штамм Брунден) в цветной реакции с использованием различных тилов клеток
Титр вируса, ТЦД^./мл
клетки почки клетки клетки клетки
макаки резус СОЦ Нер-2 HeLa
107 ю6-5 ю8 10 я
К)7,5 ю7-5 ю8 1№
106 106,5 107 104
Цветная проба, первоначально разработанная на модели вирусов полиомиелита и сыгравшая большую роль в изучении этого возбудителя, в настоящее время все шире применяется для изучения других вирусных инфекций,
Шмидт, Медулла и Леннетт {Schmidt, Medulla, Lennette, 1958) модифицировали метод цветной пробы применительно к вирусам Коксаки группы В и некоторым представителям группы А (типы 11, 13, 15 и 18). Эту реакцию ставили с клетками HeLa, КВ или перевиваемыми клетками амниона человека (штамм FL). Для приготовления 100 мл среды, применявшейся для постановки пробы, брали 5 мл сыворотки кролика, 1,5 мл 20% раствора глюкозы и 61 мл среды 199 на растворе Эрла с 2,5 мл 8,8% раствора соды. В каждую пробирку вносили по 50 000 клеток.
Титры вирусов, установленные с помощью цветной пробы, были, как правило, ниже титров, определявшихся по цитопато-генному действию. Клетки амниона человека оказались более чувствительными к вирусам Коксаки по сравнению с клетками HeLa и КВ.
Гош и Янгнер (Gaush, Jonngner, 1959) предложили применять цветную пробу для титрования вирусов гриппа разных типов и для определения нейтрализующей активности гриппозных сывороток. Авторы использовали для работы клетки почек обезьян. Они показали, что титр, вычисленный по результатам цветной пробы, обычно на 0,56 единицы логарифма ниже по сравнению с результатами титрования во вращающихся пробирках. Метод цветной пробы позволил обнаружить четкие антигенные различия между штаммами вирусов гриппа свиней, гриппа А, А2 и В. Была также показана пригодность этого метода для серодиагностики гриппа по нарастанию титра вируснейтрализующих антител в парных сыворотках больных. Отмечена высокая степень корре-
ляции между результатами серодиагностики с помощью цветной пробы и реакции торможения гемагглютинации.
Реакция цветной пробы получила широкое распространение как основной метод изучения иммунологической структуры населения в отношении трех типов вируса полиомиелита. Проведение таких исследований явилось основной предпосылкой оценки эффективности массовой иммунизации населения инактивированной и живой вакциной против полиомиелита по серологическим сдвигам.
Себин (1957) установил, что в течение заболевания полиомиелитом, а также при вакцинальном процессе, вызванном оральным введением аттенуированного вируса полиомиелита или связанном с инъекцией инактивированной вакцины, в крови появляются антитела с различной степенью авидности, т. е. способности связываться с антигеном. Малоавидные антитела обнаруживаются на более ранних стадиях, высокоавидные—позже. В реакции цветной пробы выявляются как малоавидные антитела, так и высокоавидные. Малоавидные антитела значительно лучше обнаруживаются с помощью цветной пробы. При постановке реакций нейтрализации в однослойных культурах по цитопатогенному действию устанавливают наличие лишь высокоавидных антител. По данным Себина (1957), титры антител, установленные колориметрическим методом, могут в 60 раз превышать показатели, полученные при одновременном исследовании сывороток в опытах гашения цитопатогенного действия.
