Культура ткани в вирусологических исследованиях - Анджапаридзе О.Г.
Скачать (прямая ссылка):
Интересные данные о значении цистеина для развития цитопатогенного действия вируса полиомиелита и образования его колоний в клетках почек обезьян получены Дюбосом (1956). Им ' было установлено, что при удалении из среды Игла цистеина в пробирках с однослойными культурами клеток появление ци-топатогенных изменений наблюдается только через 6—8 дней, тогда как в контрольных культурах разрушение отмечено через 3 дня. При использовании агарового покрытия без цистеина ни один из испытавшихся штаммов в разведении 10-4 и 10~5 не вызывал появления бляшек.
Заслуживает внимания также работа Барона и Лоу (Baron, Lou, 1958), предложивших вместо сыворотки вводить в состав агарового покрытия двойную концентрацию разработанной ими поддерживающей среды, в состав которой входит среда 199 с 20% специально обработанного снятого молока или среда с
0,5% гидролизата лактальбумина и молока. -
Метод бляшек нашел широкое применение при разработке экспериментальных моделей и решении ряда вопросов, связанных с изучением наследственности и изменчивости вирусов. Показана возможность получения из отдельных колоний генетических линий вирусов любой степени чистоты. Используя метод' бляшек, удалось селекционировать различные мутанты вирусов] полиомиелита, везикулярного стоматита и некоторых других. Имеются указания на то, что некоторые признаки бляшек — размеры, форма, срок появления — могут быть использованы как «метки»
1 Использовали следующие аминокислоты (мг/л): L-цвстеин HCI — 30,
L-изолейции — 40, L-гистидии НС1—10, L-аргииии НО—7, L-лизин НС1 — 8, L-метионин — 6, L-треонин —14.
ттри изучении в эксперименте закономерностей изменчивости вируса.
Предпосылкой для разработки методов получения чистых линий вирусов методом бляшек послужили работы Делбекко и Фогт (1954). Эти авторы на основании анализа результатов опытов с вирусом полиомиелита пришли к выводу, что образование бляшек обусловлено размножением в клетках одной вирусной частицы.
В ряде экспериментов Делбекко и Фогт (1954, 1955) отметили линейное соотношение между дозой внесенного вируса и числом образующихся бляшек. Было выдвинуто две гипотезы для объяснения указанной зависимости. Согласно первой гипотезе, для появления бляшки достаточно одной частицы вируса; по второй гипотезе — появление колоний имеет место только в тех случаях, когда в клетку попадает две вирусные частицы или более.
Для проверки первого предположения было высчитано теоретическое число колоний, которое может образоваться при внесении в культуру с известным числом клеток определенной дозы вируса. Согласно распределению Пуассона, при условии адсорбции на одной клетке одной вирусной частицы в культуре с числом клеток N, зараженной v дозой вируса, число образовавшихся бляшек будет равно:
a-v
1-е~ ЛГ").
Поскольку подсчет бляшек проводится в тех случаях, когда
их число не превышает 50, а значение невелико, формулу
N
можно представить в более простом выражении:
Р1 а ¦ г1.
Рассматривая полученное уравнение, легко убедиться, что между дозой вируса и и числом образовавшихся бляшек Pt существует линейное соотношение.
Обратимся ко второй гипотезе. При условии образования бляшек вследствие множественной инфекции клеток справедливо следующее уравнение:
a-v
е JvWS^-j-iYI
Lv Дат /J
av
При малых значениях число образовавшихся бляшек будет близко к значению, полученному при расчете по формуле:
N
Из последней формулы следует, что при заражении клетки двумя частицами число бляшек должно быть пропорционально
ной вирусной частиией, мож„ ?Ыть полностью1,ас ”ростра„е»о fi™ дР>гие вирусы,о поскольку в экспериментах с ними также была отмечена линеиная связь между инфицирующей дозой и получаемым числом бляшек.
Делбекко и Фогт неоднократно подчеркивали, что одну вирусную частицу, достаточную для образования бляшек и обозначаемую ими как бляшкообразуюшая доза, нельзя отождествлять с одной корпускулой вируса. Бляшкообразующая единица имеет характер частицы, которая остается неизмененной при разведениях. В состав этой частицы может входить как одно элементарное тельце, так и их конгломерат при условии, что такой гипотетический конгломерат может существовать достаточно долго. Нужно также иметь в виду, что при внесении в культуры очень больших доз вируса возможна множественная инфекция клеток и, следовательно, формирование одной бляшки в результате размножения нескольких частиц. Однако в тех условиях опыта, результаты которых анализировали Делбекко и Фогт и с которыми имеют дело экспериментаторы, а именно заражение примерно миллиона клеток 50—100 вирусными частицами практически исключается возможность множественного заражения одной клетки и получение бляшки за счет размножения нескольких частиц.
Методика выделения чистой линии весьма проста. Однако следует всегда помнить, что бляшки могут быть «загрязнены» в результате слияния соседних колоний, диффузии вируса, а также за счет неадсорбировавшихся вирусных частиц. Поэтому для выделения рекомендуется использовать только те флаконы, в которых не больше 10 бляшек, причем расстояние между ними должно быть достаточным, чтобы избежать контаминации в результате диффузии. По имеющимся данным, бляшки вируса полиомиелита могут быть использованы в том случае, если края бляшек друг от друга отстоят на 10 мм и более. Неадсорбирован-ный вирус удаляют троекратным отмыванием монослоя клеток раствором Эрла, Хэнкса или питательной среды.
