Культура ткани в вирусологических исследованиях - Анджапаридзе О.Г.
Скачать (прямая ссылка):
Сюн и Мельник (1955) значительно изменили метод Делбекко. Они предложили относительно простой состав агарового покры-
тия, в который входили: равные объемы 2,7% агара и питательного раствора. Для приготовления раствора использовали следующие ингредиенты:
Раствор Эрла в десяти- <
кратной концентрации
без фенолового крас
ного и соды . . • . . )8 мл
Стерильная дистиллиро
ванная вода ... 60 .
Телячья или обезьянья
сыворотка . ... 3.6 „
N’aHC03{7,5%) .... 5,4 .
Нейтральный красный
(1:1000)...... 3 .
Пенициллин...... 18000 ЕД
Стрептомицин .... 18000 ЕД
Такое покрытие обеспечивало длительное (до 8—12 дней) г.ыживание клеток.
Для выращивания однослойных культур рекомендуют использовать флаконы с плоскими стенками. При закрывании флаконов резиновыми пробками отпадает необходимость подачи в термостат воздуха, содержащего С02. Как показали авторы в специальных опытах, культивирование клеток в герметически закрытых флаконах не отражается на результатах титрования вируса полиомиелита методом бляшек в сравнении с результатами, полученными при использовании клеток, выращенных в атмосфере СОг. В случае отсутствия небольших стеклянных флаконов, удобных для культивирования клеток, можно использовать чашки Петри, как это предлагают С. Г. Дзагуров и К- Т. Касымов (1957). В своих опытах они применяли чашки, края которых были склеены лейкопластырем, что создавало достаточную герметичность. По сообщению Гендерсона и Тейлора (1959), удобными для получения бляшек оказались также культуры, выращенные в пробирках. Правда, использование таких культур не может найти применение при изучении вирусов, которые образуют крупные колонии, так как клеточный слой в пробирке весьма невелик по площади.
В настоящее время метод Сюна и Мельника благодаря его простоте получил широкое распространение, С помощью этого метода проводились исследования по изучению отдельных колоний вирусов полиомиелита, Коксаки, ECHO, восточного лошадиного энцефаломиелита, энцефалита Сан-Луи, западнонильского энцефалита, вирусов Маритуба, Орибока и др. (Гендерсон, Тейлор, 1959; Сюн, Мельник, 1959) {рис. 37).
Оригинальный метод получения изолированных колоний был предложен Нойесом (1959) для вируса осповакцины. В основу метода положено использование культур клеток, выращенных во флаконах, стенки которых покрыты тонким слоем плазмы. После заражения клеток для локализации цитопатогенного действия на-
носили второй слои плазмы. Жизнедеятельность клеток осуществлялась за счет диффузии через плазму солей, витаминов и аминокислот из раствора, налитого поверх плазмы. Достоинством метода Нойеса является устранение токсического действия стекла на клетку, а также отказ от применения агара, что в ряде случаев весьма желательно. Метод Нойеса был использован при изучении вируса лихорадки долины Рифт и, что очень важно, позволил получить изолированные колонии вируса кори [Такемори, Накано, Хемми (Takemo-ri, Nakano, Hemmi, 1955); Андервуд, 1959].
Ниже приводится подробное изложение методики постановки опытов Андервуда (1959), применившего метод бляшек при изучении вируса кори.
К флаконам емкостью в две унции (56,7 г) добавляют 0,4 мл куриной плазмы, а затем 0,] мл 50% экстракта куриного эмбриона. После образования сгустка в сосуд вносят 4 мл суспензии клеток HeLa, содержащей 10е клеток в 1 мл. В качестве питательной среды используют раствор, в состав которого входят 20% телячьей сыворотки, 0,5% раствора лактальбумина и 79,5% раствора Хэнкса. После образования монослоя среду сливают и на клеточный слой наносят 0,3 мл соответствующего разведения вируса. После адсорбции при 37° из чашек сливают вируссодержащую жидкость, промывают клетки средой 199, а затем добавляют 0,6 мл плазмы и 0,1 мл куриного эмбрионального экстракта для образования второго слоя плазмы. После формирования сгустка в чашки вносят питательную среду — раствор 199 с 5% бычьей сыворотки. Культуры клеток помещают в термостат при 37°, Через несколько дней бляшки выявляют, добавляя во флаконы 4 мл нейтрального красного в разведении 1 : 10 000, приготовленном на ^астворё~Э'р: ла. Послё"1шкубгщии^аш^ в течение 2—5 часов
на фоне нормальных, окрашенных в красный цвет клеток четко выявляются очаговые поражения — колонии вируса кори. Картина становится более контрастной, если после'окрашивания чашки с культурами клеток оставляют на ночь при 6°.
Портерфилд (1959) при изучении размножения вируса желтой лихорадки в культурах клеток куриных фибробластов отметил, что инфицированные клетки, хотя и сохраняют нормальную морфологию, в отличие от интактных клеток теряют способность поглощать нейтральный красный. Это наблюдение послужило поводом для проведения экспериментов по получению отдельных колоний вируса желтой лихорадки. Опыты с этим вирусом и другими трансмиссивными вирусами: вирусом шотландского,
Рис. 37. Бляшки, образованные вирусом полиомиелита.
