Культура ткани в вирусологических исследованиях - Анджапаридзе О.Г.
Скачать (прямая ссылка):
Блэк и Мельник (1955) описали образование микробляшек вируса В в культуре почечного эпителия обезьян. Эти бляшки представляли характерные очаги поражения, которые были видны лишь при малом увеличении микроскопа. Появление бляшек отмечали через 12 часов после заражения; в последующие 24—48 часов они постепенно увеличивались в диаметре, сливаясь друг с другом. По мнению указанных авторов, образование микроскопических бляшек вирусом В связано с особенностями его распространения в зараженной культуре ткани (Блэк, Мельник, 1955). При небольшой заражающей дозе в течение первых 24 часов вирус не выходит за пределы первичных фокусов поражения, так как новообразованные вирусные частицы не освобождаются из пораженных клеток в жидкую культуральную фазу, а проникают в соседние нормальные клетки. Поэтому в течение этого 'времени подсчет фокусов поражения позволяет с большой точностью вычислить титр вируса в инфекционном материале. Лишь при далеко зашедшей дегенерации наступает деструкция клеток, вследствие чего вирус освобождается в культуральную среду. На этой стадии подсчет бляшек уже не может дать правильного представления о титре вируса в инфекционном материале вследствие образования многочисленных вторичных фокусов поражения.
Аналогичные данные были получены Фарнхэмом (Farnham, 1958) при заражении культур почечных клеток обезьяны вирусом простого герпеса. Ормсби и Мельник (Ormsbee, Melnik, 1957) описали локализованные поражения почечных культур, вызываемые вирусом ECHO. Дегенерация выражалась в появлении мелких изолированных фокусов, состоящих из круглых клеток, постепенно увеличивающихся в размерах.
Основываясь на этих данных, Соммервилл (Sommervill, 1959) предложил метод микробляшек для подсчета частиц кишечных вирусов. После удаления питательной среды из пробирок с первичными культурами почечных клеток обезьяны в них вносят
0,1 мл нужного разведения вируса, содержащего от 10 до 50 ТЦД50. После равномерного распределения инфицирующего материала по поверхности клеточного слоя пробирки помещают на 1 час в термостат, затем культуры трижды ополаскивают фосфатнобуферным физиологическим раствором (pH 7,2) и вносят в них по 1 мл поддерживающей среды. Пробирки инкубируют в течение 36 часов, после чего просматривают под микроскопом, отмечая появление бляшек. Если возникает необходимость в более продолжительной инкубации, то через 12—16 часов после инокуляции в пробирки вносят небольшое количество гомотипич-ной сыворотки, вследствие чего задерживается развитие вторичных фокусов поражения. Однако полностью появление вторичных бляшек не предупреждается: в этом случае окончательное число бляшек на 10—15% превышает фактическое содержание вирусных частиц в инфекционном материале.
Автор показал, что микробляшки образуют вирусы ECHO типов 1—9, !1—20 (штаммы типа 10 не испытывали). Микробляшки, образуемые разными типами вирусов ECHO, различаются по своей морфологии. Так, вирусы ECHO типа 1 и 7 вызывают образование более крупных и диффузных очагов поражения, чем вирусы типа 2 и II. Преимуществом метода микробляшек перед обычным методом является возможность получения бляшек при заражении вирусами ECHO типа 2, 3, 5 и 6. Как известно, метод, разработанный Сюном и Мельником (1957), не позволяет обнаружить у этих вирусов способность к формированию бляшек.
Методика выявления изолированных колоний во взвесях клеток была разработана Купером (Cooper, 1955) на модели вируса везикулярного стоматита. В последующем эта методика не получила широкого применения, хотя ряд авторов считали возможным применять ее при изучении вирусов полиомиелита, лим-фоматоза и чумы птиц [Купер, 1955; Лединко, 1955; Левин, Щар-плесс, 1959; Уотерсон (Walerson, 1958)].
Первым этапом постановки опыта по методу Купера является приготовление агарового покрытия. С этой целью смешивают равные объемы питательной среды (25% экстракта куриного эмбриона или 1 % гидролизата лактальбумина, 0,1% кристаллического бычьего альбумина и 0,1% дрожжевого экстракта, 0,6% органического буфера оксиметиламинометан) и расплавленного, а потом охлажденного до 44е 1,8% агара. 6 мл такой смеси вносят в чашку Петри диаметром 100 мм, 2 мл агарового покрытия добавляют в пробирку, в которую уже были внесены клетки в 0,5 мл растворе Эрла и 0,1 мл вирусного материала. Полученную суспензию сразу же выливают в чашки на основной слой агарового покрытия. После формирования второго слоя чашки переносят в термостат.
Для выявления бляшек через 40 часов при опытах с вирусом везикулярного стоматита прибавляют нейтральный красный (1 :20 000) в растворе Эрла и после инкубации в термостате учитывают результаты.
По мнению Купера, предложенный им метод имеет следующие преимущества.
1. Возможность получения бляшек вируса в клетках, которые не образуют монослоя на стекле, или в смешанных популяциях клеток.
2. Устранение токсического действия стекла на клетки благодаря основному агаровому покрытию.
3. Исключение периода адсорбции вируса на клетках.
4. Использование при получении отдельных колоний из материала с высокой концентрацией вируса приема, применяемого в бактериологии, разведение путем последовательного растирания исследуемого образца по поверхности агара (при этом концентрацию агара в покрытии доводят до 1,2%).
