Заболевание парадонта - Грудянов А.И.
ISBN 978-5-9986-0002-9
Скачать (прямая ссылка):
Метод ПЦР нашел широкое применение в изучении естественных микробных сообществ как позволяющий обнаружить микроорганизмы, не поддающиеся выявлению другими методами. Основной прием, использующийся исследователями, — применение универсальных праймеров, гибридизуюшихся с генами рРНК всех микроорганизмов. Полученные амплифицированные фрагменты ДНК (в идеале столько, сколько видов имеется в данном микросообществе) затем сек-венируют — устанавливают последовательность нуклеотидов в них и сравнивают с последовательностями известных микроорганизмов для установления филогенетических отношений. Если при этом обнаруживаются новые виды, то данные секвенирования можно использовать для разработки новых праймеров для этих новых микроорганизмов. Кроме того, можно грубо оценивать количественное соотношение видов в сообществе, если добавить в среду реакции одновременно универсальный праймер и специфичный для данного вида. После амплификации определяют их соотношение и рассчитывают приблизительное количество клеток. Метод весьма грубый из-за того, что в геноме разных клеток содержится от 1 до 10 копий генов рРНК и это затрудняет точный подсчет. Быстрый предварительный анализ сообщества осуществляли Li и соавт., проводившие электрофорез ампликонов в градиенте мочевины и формамида, что позволяло разделить фрагменты ДНК не только по длине, но и в зависимости от содержании G+C (в градиенте мочевины и формамида).
Схема с использованием универсальных праймеров достаточно хорошо работает, если видов в микробном сообществе немного (до 20). При большем количестве видов микроорганизмов, например в ситуации с клиническими образцами, возникают многочисленные технические трудности: недостаточное разрешение полос при электрофорезе, преимущественная амплификация одних генов в ущерб другим, недостаток субстратов для ДНК-полимеразы, неодинаковый лизис микроорганизмов в процессе пробоподготовки и др.
Одной из причин артефактов при изучении микросообществ с помощью ПЦР является формирование химерных последовательностей — соединение последовательностей ДНК из разных видов. Химера образуется, когда недозрелый терминированный ампликон комплементарно присоединяется к нематеринской ДНК-матрице и копируется в последующих циклах ПЦР. Усиливают образование химерных рДНК следующие факторы: 1) присутствие в среде реакции обрывков ДНК (при выделении) или их накопление вследствие недостаточной продолжительности стадии полимеризации; 2) повышенное количество высококонсервативных повторов; 3) высокая степень родства между исследуемыми организмами. Формирование химерных ДНК дает в результате ложное увеличение биоразнообразия сообщества [12].
Внедрение в практику стоматологии современных молекулярных методов открывает новые перспективы в решении вопросов этиологии и патогенеза сто-
92
Заболевания пародонта
матологических заболеваний. Несомненно, возможность идентификации новых, малоизученных бактериальных форм, оказывающих влияние на развитие патологических процессов в тканях и органах челюстно-лицевой области, будет иметь существенное значение для решения насущных задач профилактики и лечения.
В настоящее время большинство ученых используют универсальные праймеры в попытках охарактеризовать все микробное сообщество. Однако необходимость создания праймеров, специфичных для микрофлоры ротовой полости, заставляет обратиться к методам культивирования. Ввиду объективных ограничений метода ПЦР и иммунохимического анализа требуется проверка получаемых праймеров и антител на чистой культуре микроорганизмов. Только после такой проверки можно уверенно применять новые препараты в диагностике пародонтита и других заболеваний ротовой полости.
При лечении пациентов с ВЗП нередко применяют антибиотики. Проблема выбора антибактериальных средств, контроля их эффективности, выявление резистентности микроорганизмов к назначенному лечению могут решаться посредством использования молекулярных методов. Поскольку зачастую в клинике антибактериальные препараты назначаются без должного учета всех факторов, задачу внедрения молекулярных методов исследования, в частности ПЦР, в клиническую стоматологию на сегодняшний день следует признать в высшей степени актуальной.
Применение методов молекулярной диагностики также способствует развитию исследований в области изучения генов устойчивости к антибиотикам. Так, ПЦР была использована для выявления локусов ДНК, ответственных за устойчивость к тетрациклину и эритромицину у анаэробных микроорганизмов (Fusobacterium, Prevotella, Porphyromonas). Местное назначение тетрациклина, поданным ряда авторов, может приводить к появлению в ПК бактерий, устойчивых к этому. Согласно Villedieu и соавт. (2002), примерно 11 % культивируемых организмов ротовой полости устойчивы к тетрациклину. Показано разнообразие генов устойчивости к тетрациклину в микрофлоре ротовой полости у взрослых здоровых лиц. Интересные результаты были продемонстрированы этими авторами при исследовании образцов слюны и зубных бляшек, полученных от 20 здоровых взрослых, не принимающих антибиотики в течение предыдущих 3 мес. Было описано 8 классов генов устойчивости к тетрациклину, кодирующих рибосомный белок и найденных у Veilonella, Prevotella, Streptococcus, Staphylococcus, Streptomyces, Lactobacillus, Neisseria, Enterococcus. Гены устойчивости обнаружены как у грамположительных, так и грамотрицательных микроорганизмов. Гены устойчивости грамотрицательных микроорганизмов широко распространены по геному и связаны с большими плазмидами, большинство из которых способно перемещаться. Гены устойчивости грамположительных микроорганизмов обычно находятся на малых передающихся плазмидах. Показано, что некоторые бактерии (Neisseria, Haemophilus, Streptococcus) распространяют гены устойчивости к тетрациклину посредством транспозонов. В другом исследовании было обнаружено, что многие виды бактероидов несут большое количество новых самопередающихся хромосомных элементов с геном устойчивости к тетрациклину Тсг. Некоторые элементы несут также ген устойчивости к эритромицину Tmr. Эти элементы вставлены в хромосому бактероидов и передаются самостоятельно от хромосомы донора к хромосоме реципиента.
