Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Медицина -> Грудянов А.И. -> "Заболевание парадонта" -> 46

Заболевание парадонта - Грудянов А.И.

Грудянов А.И. Заболевание парадонта — Медицинское информационное агенство, 2009. — 328 c.
ISBN 978-5-9986-0002-9
Скачать (прямая ссылка): zabolevaniyeparadonta2009.djvu
Предыдущая << 1 .. 40 41 42 43 44 45 < 46 > 47 48 49 50 51 52 .. 153 >> Следующая

Иммунохимические методы ограниченно пригодны для идентификации микроорганизмов, поскольку с их помощью сложно разграничить штаммы одного и того же вида (обладают сходными антигенными детерминантами и возможны ложноположительные результаты), и непригодны для определения некультивируемых микроорганизмов, так как невозможно получить очищенные антигены для иммунизации животного.
Решением этой проблемы могут служить антитела с флюоресцентной меткой, специфически взаимодействующие с определенной последовательностью нуклеотидов рибосомной РНК.
Гибридизация in situ
Гибридизация in situ — это молекулярно-биологический метод, основанный на специфической гибридизации специального олигонуклеотид ного зонда с РНК рибосомы. Рибосомы присутствуют во всех клетках, и их структура хорошо изучена. Определенные участки рибосомной РНК не покрыты белками и могут взаимодействовать по принципу комплементарное™ с нуклеотидными зондами, помеченными флюоресцентными красителями или антителом. Последовательность нуклеотидов зонда подбирается таким образом, чтобы связываться с рРНК только одного вида клеток, что позволяет выявлять такие клетки под микроскопом. Процедура гибридизации in situ следующая: клетки фиксируются (на подложке или в тонком срезе) и в процессе фиксации погибают. Мертвая клетка становится проницаемой для крупных молекул, в том числе для олигонуклеотидных зондов.
90
Заболевания пародонта
На слой клеток наносится краситель с зондами, которые проникают внутрь клетки, связываются там с рРНК, если она комплементарна их последовательности. Через некоторое время избыточное количество красителя отмывают, а связавшиеся зонды обнаруживают микроскопически по развитию той или иной окраски. Если целевых последовательностей рРНК нет, то цветной реакции не наблюдается. При использовании флюоресцентных красителей метод называется FISH — флюоресцентная гибридизация in situ.
Метод достаточно прост и в соединении с проточной цитометрией используется для количественного анализа микробных сообществ. Кроме того, с его помощью можно выявлять растущие молодые клетки, в которых много действующих рибосом и, следовательно, окраска у них более интенсивная.
Последние модификации данного метода позволяют обнаруживать низко-копийные плазмиды (от 10 до 1000 копий на клетку) или хромосомы (менее 10 копий). Эти методы отличаются от pPHK-FISH использованием полинуклео-тидных зондов (от 50 до 1200 нуклеотидов в длину), высокой (1000-кратной) концентрацией зонда и более долгим временем гибридизации. Техника называется RING-FISH из-за того, что вокруг целевых клеток образуется круговое сияние флюоресценции. Метод также может быть использован для обнаружения клеток, зараженных вирусом или внутриклеточными паразитами.
При всех своих достоинствах метод обладает определенными ограничениями. Во-первых, для эффективного микроскопирования клетки обязательно нужно концентрировать, что не всегда возможно. Во-вторых, при фиксации клеток структура рибосом нередко изменяется таким образом, что целевой участок рРН К становится физически недоступным для зонда и приходится применять особые техники (добавление формамида) для его обнаружения. В-третьих, медленно растущие клетки трудно обнаружить из-за низкого количества в них рибосом [12].
Полимеразная цепная реакция
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — метод, широко распространившийся в последнее время в клинической диагностике. Метод имитирует естественную репликацию нуклеиновых кислот и позволяет получать фрагменты последовательности ДНК в количествах, достаточных для детекции.
В настоящее время использование ПЦР стремительно расширяется в диагностике инфекционных, онкологических, генетических заболеваний и для идентификации личности. В отличие от ИФА ДНК-диагностика позволяет выявить возбудителя заболевания напрямую — его геном. С помощью специальных схем постановки ПЦР можно определять патогенные организмы в очень низкой концентрации.
ПЦР клинического образца включает в себя три основных этапа: пробоподготов-ка (выделение ДНК из клинического материала), амплификация (умножение фрагментов ДНК) и регистрация результатов. Из клинических образцов, взятых от больных и доставленных в ПЦР-лабораторию, выделяют нуклеиновые кислоты (ДНК или РНК), являющиеся матрицей в реакции амплификации. Последняя представляет собой многократно повторяющиеся циклы синтеза специфической области нуклеиновой кислоты с помощью термостабильного фермента ДНК-полимеразы. В каждом цикле число копий амплифицируемого участка удваивается. За 30—40 циклов происходит накопление коротких специфических фрагментов в количестве,
Глава 3. Методы диагностики заболеваний пародонта
91
достаточном для их дальнейшей детекции. Детекция продуктов амплификации осуществляется с помощью электрофореза в агарозном геле, или путем гибридизации со специфическим олигонуклеотидным зондом, или с использованием метода масс-спектрометрии и т. д. Отличительной особенностью ПЦР-диагностики является универсальность подхода для выявления различных инфекционных агентов: бактериального, вирусного, эукариотического происхождения.
Предыдущая << 1 .. 40 41 42 43 44 45 < 46 > 47 48 49 50 51 52 .. 153 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed