Заболевание парадонта - Грудянов А.И.
ISBN 978-5-9986-0002-9
Скачать (прямая ссылка):
88
Заболевания пародонта
литическую практику и широко используются в различных областях медицины. Как правило, к антителу прикрепляется метка, которая обнаруживает себя при образовании комплекса «антиген — антитело». В качестве метки может использоваться фермент, осуществляющий цветную реакцию (иммуноферментный анализ), или флюоресцентный краситель (иммунофлюоресценция).
Антигеном — веществом, против которого могут быть получены антитела, могут являться белки, полисахариды, реже — нуклеиновые кислоты, т. е. довольно крупные молекулы или клетки, на поверхности которых такие молекулы имеются. Таким образом, иммунохимические методы выявляют не возбудителя заболевания, а молекулы, сопутствующие ему, следовательно, они являются непрямыми методами анализа.
Антитела образуются не ко всей молекуле белка или бактериальной клетки, а только к небольшим участкам на их поверхности — антигенным детерминантам или эпитопам. Понятие «антигенная детерминанта» включает в себя последовательность образующих ее химических функциональных групп и их пространственное расположение. Такие участки у белков включают не менее 5 аминокислотных остатков, у разветвленных полисахаридов — 4—6 остатков сахаров. Эпитопы распознаются антителами с достаточно высокой специфичностью: разные антитела образуются уже при перемещении одной и той же группировки к соседнему атому углерода.
Количество эпитопов — участков поверхности антигена, с которыми может связываться антитело, принципиально не ограничено и составляет до десятков у крупных белков [2]. Если два антигена имеют только часть одинаковых антигенных детерминант, их называют перекрестно реагирующими антигенами.
Наибольшее распространение среди ферментов в настоящее время получили пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза. Для фотометрической регистрации активности пероксидазы предпочтительным в настоящее время является использование субстрата тетраметилбензидина. После остановки ферментативной реакции серной кислотой измеряют оптическую плотность раствора при длине волны 450 нм. Анализ проводят следующим образом. В лунки поли-стирольного планшета с сорбированными в них антителами вносят анализируемый образец, инкубируют в течение 1 ч, при этом анализируемый антиген вступает в реакцию с антителами и образует иммунокомплекс на поверхности лунок. Планшет отмывают от несвязавшихся компонентов и добавляют меченные ферментом антитела. После вторичной инкубации и удаления избытка меченых антител добавляют субстрат фермента и определяют скорость его превращения в окрашенный продукт, которая пропорциональна начальной концентрации исследуемого антигена.
Для получения антител к нужному антигену (например, к поверхностному полисахариду микроорганизма) антиген нужно получить в чистом виде и иммунизировать им животное (обычно кролика). Антитела, которые образуются в крови иммунизированного животного, связываются с различными эпитопами молекулы-мишени. Такую смесь антител называют поликлональным препаратом. Использование поликлональных антител имеет два недостатка, существенных для диагностики: 1) содержание антител в препарате может варьировать от одной партии к другой; 2) поликлональные антитела нельзя применять, если необходимо дифференцировать две сходные мишени.
Глава 3. Методы диагностики заболеваний пародонта
89
Эти проблемы вполне разрешимы при использовании моноклональных антител, реагирующих с одним-единственным эпитопом на поверхности молекулы-мишени. Однако препараты моноклональных антител дороги, так как их получают из генно-инженерной культуры клеток, а также зачастую имеют сравнительно низкое сродство к субстрату, низкую аффинность.
Высокая чувствительность в сочетании с быстротой анализа (от нескольких минут до нескольких часов), возможностью одновременного тестирования большого количества образцов и отсутствием особой необходимости предварительных операций по очистке и концентрированию анализируемого соединения в образце придают иммуноферментному анализу (ИФА) неоспоримые преимущества перед другими аналитическими методами. К ограничениям метода относится возможное присутствие в тестируемых образцах кофакторов, ингибиторов и стимуляторов активности ферментов. Еще один недостаток — ИФА не позволяет различать нативные белки и их биологически неактивные фрагменты, сохранившие антигенные детерминанты (обломки клеток). Также помехой для ИФА может быть изменение каталитической активности фермента при его конъюгировании с антигеном. ИФА применим лишь к хорошо изученным системам, где есть очищенные антигены и высокоспецифные антитела. Если молекулой-мишенью является белок, то необходимо обеспечить экспрессию детерминирующих его генов и создать условия, в которых не происходит маскирования или блокирования сайта связывания с антителом. Флюоресцентно меченные антитела используются для молекулярной диагностики поверхностных антигенов, таких как капсулярные, фла-геллярные белки, полисахариды, или внутриклеточных антигенов (рибосомные белки, или белки, специфические для цитоплазматических протеинов).
