Заболевание парадонта - Грудянов А.И.
ISBN 978-5-9986-0002-9
Скачать (прямая ссылка):
Глава 3. Методы диагностики заболеваний пародонта
93
Следует признать, что изучение устойчивости у бактерий ротовой полости к различным антибиотикам в настоящее время является одним из приоритетных научных направлений.
Сочетание методов ПЦР и культивирования
Интересным примером сочетания двух методов — ПЦР и культивирования — является исследования ДНК (РНК) для обнаружения патогенных микроорганизмов, вызывающих болезни пародонта, с использованием бактериальной культуры. На первом этапе проводят посев клинических образцов на микробиологические среды (первичный бактериальный посев). Затем полученная смешанная бактериальная культура изучается с помощью методов молекулярной диагностики. Данный подход позволяет идентифицировать намного большее количество образцов бактериального налета и зубных бляшек, сокращает суммарное время анализа и повышает чувствительность метода исследования благодаря молекулярным методам, но в то же время первичный посев снимает проблему излишней чувствительности метода ПЦР.
Ряд авторов указывают на расхождение данных, полученных с помощью культуральных методов, и результатами исследований с применением молекулярных методов диагностики микрофлоры ротовой полости. Это объясняется, в частности, несовершенством принятых в классической микробиологии способов видовой идентификации бактерий посредством изучения их биохимических характеристик, а также наличием в клинических образцах некультивируемых микроорганизмов. Например, из 160 образцов, полученных культуральным методом и достоверно определенных на основе биохимических характеристик как P. intermedia, 29 были идентифицированы неверно. При оценке методом ПЦР 24 из них оказались P. nigrescens, 4 — Prevotella spp., 1 — Porphyromonas spp.
Развитие новых технологий позволило разработать большое количество молекулярных методов, основанных на ПЦР, которые имеют значительные преимущества в скорости и чувствительности. Одним из молекулярных методов является ПЦР в реальном времени (real-time PCR). Она позволяет проводить детекцию продуктов амплификации в процессе реакции и вести мониторинг кинетики накопления ампликонов. Детекция продуктов амплификации проводится в реакционном растворе за счет специфичной гибридизации продукта с олигонуклеотид-ным зондом, несущим флюоресцентную метку. В процессе реакции происходит высвобождение флюоресцентной метки в раствор, что дает возможность ее определения на флюоресцентном детекторе. Данный способ детекции является альтернативой электрофоретическому методу и имеет ряд существенных преимуществ:
• высокая специфичность детекции, обусловленная применением гибриди-зационной схемы с использованием высокоспецифичных олигонуклеотид-ных зондов;
• высокая производительность;
• возможность проведения реакции амплификации и детекции в одном приборе, что существенно снижает риск контаминации ампликонами;
• возможность количественной оценки исходной ДНК-матрицы;
• регистрация и учет данных в электронном формате.
Метод демонстрирует высокую положительную прогнозирующую ценность в обнаружении некультивируемых и трудно культивируемых видов бактерий. В сравнительных исследованиях поддесневых образцов бляшки от 259 пациентов
94
Заболевания пародонта
с тяжелым пародонтитом отмечена высокая линейная корреляция между положительными и отрицательными результатами бактериального метода и ПЦР в реальном времени. Эти результаты подтверждаются другими исследованиями. Также найдена положительная корреляция между ПЦР и бактериологическими методами в количественной оценке бактерий, начиная с 104 бактериальных клеток в 1 мл.
Таким образом, метод ПЦР имеет решающее значение для диагностики представителей анаэробной микрофлоры, микроаэрофилов, внутриклеточных паразитов, так как они относятся к некультивируемым или трудно культивируемым микроорганизмам.
Однако метод ПЦР при своей все более увеличивающейся популярности ни в коем случае не заменяет, а лишь дополняет спектр традиционных методов (микроскопический, культуральный, биохимический и т. д.), используемых в диагностике заболеваний пародонта.
В целом каждый из методов диагностики патогенных микроорганизмов обладает своими достоинствами и своими ограничениями, которые кратко суммированы в табл. 3.2.
Таблица 3.2
Сравнение некоторых методов диагностики инфекционных заболеваний, вызванных микроорганизмами
Метод Преимущества Недостатки
Микроскопическое Простота Трудоемкость
исследование Прямое выявление микроор Длительность
ганизмов Низкая чувствительность
Возможность разграничения Невозможность разграничения
микроорганизмов по морфо похожих микроорганизмов
логическим признакам Необходимость высокой ква
лификации для интерпретации
результатов
