Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
1,2 см) и одну контрольную трубку объемом 2 мл при внутреннем диаметре 2
мм. Трубки (стеклянные или пластиковые) имеют длину 16 см. Для устранения
молекулярно-ситовых эффектов используют гели с очень крупными порами -
Т=4%, С-4% (определение величин Т и С, предложенных Hjerten, 1962, дано в
разд. 3.2.8).
Заполимеризованные гели перед использованием выдерживают при 4ЮС.
Максимальная загрузка для самых широких трубок составляет около 200 мг
белка. Образцы можно наносить на верхний торец геля или же включать в
состав исходного раствора мономеров до полимеризации геля.
По разрешающей способности такая препаративная система сопоставима с
аналитической. Как и в других гелевых средах, концентрация белка в зоне
может быть настолько высока, что даже неокрашенные сфокусированные белки
часто хорошо различимы невооруженным глазом: они имеют вид матовых
дисков. Методология ИЭФ в трубках с ПААГ детально рассмотрена для
аналитического варианта в разд. 3.2.7 и практически полностью применима к
препаративному варианту фракционирования. Однако необходимо учитывать,
что при переходе к более толстым гелям эффективность теплоотвода
снижается, поэтому электрическую мощность не следует увеличивать прямо
пропорционально объему геля.
Упомянутый выше прибор для ИЭФ в трубках (аналитический вариант изображен
на рис. 3.21) выпускается фирмой MRA, Boston, МА (USA). Основные проблемы
препаративного фракционирования в полиакриламидном геле связаны с
обнаружением и извлечением белков после ИЭФ. Разрезание геля на сегменты
с последующей элюцией буфером часто сопровождается низким выходом и
значительным разбавлением образцов. В работе Suzuki et al., 1973, был
описан другой весьма остроумный метод извлечения белков из геля.
Стандартную (пустую) трубку закрывают снизу диализной мембраной и
наливают в нее немного "тяжелого" буферного раствора.. Поверх этого
раствора полимеризуют "пробку" - короткий столбик полиакриламидного геля.
Один из сегментов, вырезанных после ИЭФ в геле, измельчают и переносят на
поверхность "пробки" в виде
150
Глава 2
суспензии в тяжелом буферном растворе. После этого трубку доверху
заполняют буфером и проводят электрофоретическую элюцию образца с помощью
того же самого прибора. Элюируемые компоненты удается получать с хорошим
выходом в виде концентрированных растворов, практически свободных от
амфолитов, которые беспрепятственно проходят через мембрану. Аналогичная
система электроэлюции была описана также в работе Chrambach et al., 1973.
2:2.6. ИЭФ в пластинах полиакриламидного и агарозного гелей
Для препаративного ИЭФ в плоском слое помимо гранулированных гелей типа
сефадекса можно использовать и сплошные пластины полиакриламидного или
агарозного гелей. Этот подход имеет определенные преимущества по
сравнению с ИЭФ в толстых трубках главным образом благодаря тому, что при
ИЭФ в пластинах геля возможен значительно более эффективный отвод тепла.
При фокусировании в пластине ПААГ было также отмечено несколько более
высокое разрешение, чем в слое сефадекса (Gaesslin, Weise, 1974). Для
аналитического и препаративного ИЭФ в пластинах геля может использоваться
одна и та же аппаратура. Толщина слоя геля может быть увеличена просто за
счет использования более широких прокладок ("спейсеров") при
полимеризации. Образцы можно наносить на горизонтальную поверхность геля
либо непосредственно в виде полоски раствора, либо с помощью кусочков
толстой фильтровальной бумаги, смоченных в растворе образца. Для внесения
образца (в растворе или на бумаге) можно использовать также специально
вырезанные в геле лунки или желобки. Разрешающая способность
препаративного варианта сопоставима с разрешающей способностью ИЭФ в
тонких аналитических гелях. При использовании кварцевой подложки
сфокусированные белковые зоны можно регистрировать прямо в геле УФ-
сканирова-нием с помощью спектрофотометра (фирмы Zeiss). Положение
белковых зон можно также определить, быстро окрашивая полоски геля,
отрезанные с двух концов пластины (параллельно направлению миграции; см.
рис. 2.27). Белки извлекают из геля с помощью обычной или
электрофоретической элюции (разд. 4.6). Многие исследователи склонны
сомневаться в эффективности обычной элюции белков из ПААГ. Тем не менее,
как описано в работе Graesslin, Weise, 1974, с помощью обычного
встряхивания сегментов геля в элюирующем буфере авторам удавалось
извлекать белки с общим выходом 74%.
Препаративное ИЭФ в агарозе стало возможным (Chapius-Cellier, Arnaud,
1981) только после того, как в продажу начала
Препаративное ИЭФ______________________________151
в
Рис. 2.27. Способ локализации белковых зон при препаративном ИЭФ в тонком
слое. А - неокрашенная центральная часть пластины геля, Б и Б' - боковые
полоски геля, окрашенные СВВ. Положение сфокусированных зон в пластине А
устанавливают с помощью зубчатых разрезов между А, Б и Б'. (Graesslin,
Weise, 1974.) (
поступать специально очищенная агароза, практически не содержащая
