Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
решетку на рамку и тем самым разделяют слой геля на 30 фракций. Фракции
извлекают из желобков с помощью шпателя. (Winters et al., 1975; с
любезного разрешения LKB Produkter АВ.)
сана конструкция рамки для препаративного ИЭФ в слое сефадекса, которая
подходит к многоцелевому аппарату Multiphor 2117 производства фирмы LKB
(разд. 3.2.14). Такая рамка (см. рис. 2.24), снабженная устройством для
внесения образца и "фракционирующей решеткой" из нержавеющей стали,
предназначенной для разделения слоя на 30 сегментов, поставляется LKB
Produkter АВ. Располагая аналогичными приспособлениями, имеющуюся в вашем
распоряжении аппаратуру можно использовать одновременно и для
аналитического, и для препаративного фракционирования. В системе,
отработанной Winters et al., 1975, применяется слой геля толщиной не
более 5 мм, с тем чтобы нижняя и верхняя его части охлаждались примерно
одинаково и не происходило искажения зон. Максимальная загрузка слоя
может составлять от 200 до 400 мг белка в зависимости от гетерогенности
исходной смеси. Свежеприготовленную кашицу геля (около 5 г сухого
материала на 200 мл 2%-ного раствора амфолинов) выливают на лоток, не
дожидаясь полного набухания геля. Испарение воды ускоряется с помощью
небольшого настольного вентилятора, закрепленного в 1 м над лотком, и
продолжается в течение 2-3 ч до того, как испарится 20-50% всей воды,
содержащейся в суспензии. Затем лоток с гелем переносят на охлаждающий
столик аппарата Multiphor, с помощью соответствующего приспособления
наносят образец и ведут ИЭФ в течение 10 ч при Ю^С и мощности 10 Вт,
контролируемой источником питания со стабилизацией по мощности.
Электроды, как правило, устанавливают по коротким сторонам слоя таким
Препаративное ИЭФ
14&
образом, что разделение белков происходит в длину (расстояние между
электродами 25 см). С помощью "фракционирующей решетки" (рис. 2.24)
разделяют гель на 30 сегментов, которые вынимают из желобков при помощи
шпателя. Для извлечения белка из геля последний помещают в цилиндр
шприца, дно которого закрыто стекловатой, добавляют сверху порцию элюента
и прокачивают элюент через гель с помощью обычного поршня (Winters et
al., 1975).
Совершенствование техники препаративного ИЭФ в слое гранулированного геля
побудило других авторов к разработке простого и эффективного сканирующего
устройства для прямой регистрации сфокусированных зон (Holmquist,
Brostrom, 1979). Сканирующее устройство встроено в латунную коробку,
закрепленную на спектрофотометре (модель Beckman DU). Световой пучок от
монохроматора отражается зеркалом и направляется через кварцевую
пластинку, которая служит подложкой для геля. С помощью этого устройства
можно легко локализовать белковые зоны в слое геля. Такой метод
детектирования является весьма быстродействующим; он позволяет следить за
тем,, происходит ли искажение зон в процессе ИЭФ. Кроме того, в отличие
от метода бумажных реплик сканирование не сопровождается частичной
потерей материала.
Метод Радолы нашел еще одно важное применение - для электрофоретической
десорбции белков, прочно связанных с аффинными сорбентами (Haff et al.,
1979; Lasky, Manrique, 1980). После предварительного фокусирования
амфолитов в слое гранулированного геля ближе к краю пластины делают узкую
канавку, в которую загружают порцию аффинного сорбента, несущего искомое
вещество. Десорбция протекает быстрее при максимальном увеличении
суммарного заряда десорбируемого вещества, поэтому зону аффинного
сорбента помещают на максимальном удалении от области фокусирования
десорбируемого^ белка. После десорбции и фокусирования зоны искомых
белков регистрируют, белки извлекают из геля и отделяют от амфолитов
гель-фильтрацией.
Возможны некоторые варианты применения метода: расщепление комплексов
между антителами и иммобилизованными антигенами (и наоборот), десорбция
белков с гидрофобных сорбентов и извлечение белков из агарозных и
полиакриламидных гелей.
В работах O'Brien et al., 1976, и Johnson et al., 1976, описана еще одна
модификация метода Радолы. Авторы проводили ИЭФ в колонке, заполненной
сефадексом G-15, с обоих концов закрытой пробками из полиакриламида. Для
облегчения процедуры удаления пробок ПААГ был заполимеризован в
нейлоновых сетках. После ИЭФ и удаления пробок в нижнюю часть колонки
10-1488
148
Глава 2
помещали плунжер и элюировали сфокусированные зоны раствором, содержащим
амфолиты и глицерин, или просто дистиллированной водой. При загрузке до
300 мг белка на зону авторам удавалось получать разделяемые компоненты с
выходом около 96%. В работах Otavsky et al., 1977, и Harper, Kuepers,
1980, были исследованы возможности применения других, отличных от
сефадекса или гранулированного полиакриламида незаряженных матриц для
создания антиконвекционной среды при ИЭФ. Обнадеживающие результаты были
получены при ИЭФ в слое гранулированного инертного пластика певикон С-870
(диаметр гранул 100 мкм), который представляет собой продукт
