Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
По-видимому, наиболее интересной особенностью этой конструкции следует
считать систему сбора фракций. Она представляет собой цепочку из 188
выходных каналов, которые образованы сквозными отверстиями (диаметром 0,4
мм), проделанными в блоке из силиконовой резины (расстояние между
центрами соседних отверстий 0,8 мм). Эта система позволяет собирать очень
узкие фракции и тем самым гарантирует высокое разрешение при элюции
сфокусированных зон.
В табл. 2.3 сравниваются различные системы проточного ИЭФ в плоском слое,
в которых фракционирование проводится
Электролит (выход)
Рис. 2.22. А. Общий вид и устройство камеры для проточного ИЭФ в
гранулированном геле. 1-подложка из тонкого стекла, 2 - верхняя пластина
из толстого стекла, 3 - электродный блок, 4 - диализная трубка, 5 - сбор
фракций, 6 - слив, 7 - блок охлаждения. Затемненная поверхность указывает
расположение слоя гранулированного геля. Б. Четыре разреза камеры. 1 -
слой геля, 2 - желобок, 3 - отвод газа, 4 - электролит (выход), 5 -
электродный блок, 6 - диализная трубка, 7 - электролит (вход), 8 -
штеккер, 9 - электрод, 10-блок охлаждения, 11-стеклянная подложка, 12 -
желобок, 13 - верхняя стеклянная пластина, 14 - сбор фракций, 15 -
перистальтический насос. (Quarmby, 1981.)
Таблица 2.3. Сравнение технологических параметров проточных систем
изоэлектрофокусировання и электрофореза
в плоском слое (Quarmby, 1981)
Размеры разделительной камеры, мм Устройство системы
сбора фракций
Тип системы толщи- на длина ширина общее число выходов число
выходов на 1 мм ширины камеры Объекты фракционирования '
Литература
Циклическое ИЭФ 20 200 20 10 0,5 Белки Egen et al., 1979
Разделение в вертикальном свободном потоке 0,5 360 110 48 0,44
" Bier et al., 1980 Seiler et al., 1970
0,7 510 120 92 0,77 Эритроциты Just et al., 1972, 1977
Hannig et al., 1975, 1978
Разделение в горизонтальном свободном потоке 0,5 440 500 48 0.1
Панкреатическая амилаза Аминокислоты Prusik, 1974 Prusik, 1975
0,4 320 210 118 0,56 Неорганические вещества Wagner et
al., 1978
"Капиллярная" стабилизация 3 300 230 54 0,23 Белки Fawcett,
1973 }
9,5 250 200 36 0,18 Гемоглобин, альбумин Hendeskog, 1975
6 225 140 12 0,09 Синтетические амфолиты Gianazza et al.,
1975
2 200 150 188 1,25 Quarmby, 1981
Препаративное ИЭФ
141
в свободном потоке или с использованием "капиллярной" стабилизации (т. е.
стабилизации, основанной на использовании гранулированных гелей).
2.2.3. ИЭФ в гранулированных гелях (не проточное)
В работах Radola, 1973 а, b и 1975, описан весьма эффективный метод
крупномасштабного препаративного ИЭФ в слое гранулированного геля. Для
приготовления слоя используют суспензии таких гелей, как сефадекс G-75
(7,5 г/100 мл) или сефадекс G-200 (4 г/100 мл); оба - категории
"суперфайн", а также биогель Р-60 с зернением мельче 400 меш (4 г/100
мл). Слой формируют на стеклянной или кварцевой пластине, которую можно
поместить на дно формы из оргстекла (рис. 2.23). Обычно размеры пластины
40X20 см (или 20X20 см), а толщина слоя - до 10 мм. Полный объем геля
может составлять от 300 до 800 мл. Для образования слоя "кашицу" (slurry)
сефадекса, содержащую 1%-ные амфолины, выливают на пластину и высушивают
на воздухе до достижения рабочей консистенции. Приготовление слоя четко
определенной консистенции решающим образом сказывается на результатах
последующего ИЭФ. По-видимому, наилучшие результаты можно получить в
слое, который образуется после испарения около 25% воды и при наклоне
пластины до 45° остается неподвижным. При ИЭФ пластину помещают на
поверхность специального блока, охлаждаемую до 2-10°С. Электрическое поле
прикладывается с помощью платиновых электродных полосок, которые
контактируют с гелем через прокладки из толстой фильтровальной бумаги,
смоченные 1М серной кислотой (на аноде) и 2М этилендиамином (на катоде).
В наиболее крупномасштабных опытах напряженность поля возрастала от 10-15
В/см (в начале) до 20-40 В/см (в конце ИЭФ). При толщине слоя 1 см
удается рассеи-
Рис. 2.23. Препаративное ИЭФ в гранулированном геле. А. Полупрепаратив-
ное фракционирование. Б. Крупномасштабное фракционирование. 1 - электрод,
2 - полоска толстой фильтровальной бумаги, смоченная электродным
раствором, 3 - охлаждаемый столик, 4 - стеклянная пластина, 5 - слой
геля, 6 - сфокусированные белки, 7 - рамка (Radola, 1975.)
142
Глава 2
вать тепло, выделяющееся при мощности тока до 0,05 Вт/см3. Образцы можно
предварительно смешивать с суспензией геля или наносить на поверхность
готового слоя. Большие объемы образца следует смешивать непосредственно с
сухим сефадексом (около 60 мг сефадекса G-200 на 1 мл жидкости) и
заливать в углубление, сделанное в слое геля. Образцы можно наносить на
любом участке рабочего пространства геля. Для предотращения пересыханиХ
поверхности в процессе ИЭФ целесообразно закрывать ее крышкой. Прибор
подходящей конструкции, так называемая "двойная камера", выпускается в
