Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
заряженных групп (например, Isogel фирмы Marine Colloids, Rockland,
Maine). Гель готовят на основе 0,8%-ного раствора агарозы, содержащего 2%
амфолитов-носителей. В качестве электродных растворов следует
использовать слабые растворы электролитов, например 0,1 М NaOH и 0,1М
уксусную кислоту. В пластине размером 84x30x2 мм при мощности 15 Вт
фокусирование продолжается 8 ч (начальные условия: 500 В и 30 мА;
конечные - 1500 В и 10 мА). Пластину геля разделяют на 30 сегментов с
помощью фракционирующей решетки, изображенной на рис. 2.24; сегменты
измельчают и трижды экстрагируют подходящим буфером. Авторы сообщали о
фракционировании до 1 г сывороточных белков с выходами от 68 до 82%.
2.2.7. Хроматофокусирование и амфолит-вытеснительная хроматография
Хроматофокусирование впервые было описано в работах Sluyterman, Wijdenes,
1977, 1978, 1981 а, b, и Sluyterman, Elger-son, 1978. Было показано, что
при хроматографии на ионообмен-нике в градиенте pH белки фокусируются и
выходят с колонки при значениях pH элюента, близких к их pi. Таким
образом, хроматофокусирование должно сочетать высокую разрешающую
способность, обусловленную фракционированием по различию в
152
Глава 2
значениях pi, с хорошими препаративными возможностями, характерными для
ионообменной хроматографии. Хроматографические пики при
хроматофокусировании выходят в узких интервалах pH, в пределах 0,04-0,05
ед. pH. За один опыт можно проводить фракционирование образцов,
содержащих несколько сот миллиграммов белка. Рассчитано (Sluyterman,
Wijdenes, 1981), что интервал pH выхода белковой зоны ("ширина" зоны) при
хроматофокусировании выражается соотношением
ДрН^± (50)
где Ф определяется как
y = F$RT. (51)
Здесь ф - потенциал Доннана, dpH/dV - наклон градиента pH, отнесенного к
единице площади поперечного сечения, dZ/dpH - наклон кривой титрования
белка вблизи его pi. Следует обратить внимание на сходство между этим
математическим выражением и уравнением (23), выведенным в работе
Rilbe, 1973 а, для разрешающей способности при ИЭФ. Сход-
ство становится очевидным, если учесть, что градиент напряженности поля Е
в уравнении (23) соответствует потенциалу ф в уравнении (50), подвижность
белка и соответствует заряду Z, а диффузией при хроматофокусировании
фактически можно пренебречь (Sluyterman, Wijdenes, 1978).
Как же в действительности проводят хроматофокусирование? Во-первых,
выбирают подходящую анионообменную колонку и
Скорость элюции
IIIII Н IIII11НШ ¦¦¦¦¦¦¦¦!
Скорость миграции
lining lining
Белок 1 Белок 2
ВВВ (c)О0 '
0 ? В (c)О(c) '
ввв (c)о(c)
Рис. 2.28. Поведение белковых молекул при хроматофокусировании. pH
возрастает при движении по колонке сверху вниз. В той области, где pH
оказывается выше pi данного белка, последний приобретает отрицательный
заряд и начинает связываться с обменником. При pH ниже изоточки белок
"отталкивается" от положительно заряженной матрицы, а при pH-pi не
"отталкивается", но и не связывается. На рисунке гипотетический белок 1
имеет р1=7, а белок 2 - pi-8. (С любезного разрешения Pharmacia Fine
Chemicals.)
Препаративное ИЭФ
153
уравновешивают ее при самом высоком значении pH, которое будет
использовано при фракционировании. Образец растворяют в буфере при самом
низком рабочем значении pH, диализу-ют против этого "кислого" буфера и
наносят на колонку. Рабочий интервал pH выбирают таким образом, чтобы
значения pi разделяемых компонентов приходились примерно на середину
градиента pH. Для получения хороших результатов ширина рабочего интервала
pH в одном опыте не должна превышать 3 ед. pH. После нанесения образца
ведут элюцию "кислым" буфером. За счет кислотно-основного обмена между
буфером и ионооб-менником образуется градиент pH в пределах двух крайних
значений pH двух рабочих буферов. Участок, на который распространяется
градиент pH, постепенно продвигается вниз по колонке. В конце концов
белки выходят из колонки в градиенте pH в порядке убывания значений pi.
Поведение белков при хроматофокусировании проиллюстрировано на рис. 2.28.
При миграции белка вниз по колонке он поначалу находится недалеко от
исходной зоны кислого буфера при pH ниже значения своего pi. При этом
белок в целом заряжен положительно; он отталкивается от положительно
заряженной матрицы и продвигается по колонке, практически не
задерживаясь. Однако постепенно, попадая в более щелочную область
градиента pH, белок перезаряжается и начинает связываться с
ионообменником. Белок остается связанным с матрицей до тех пор, пока
значение pH на соответствующем участке колонки, по мере продвижения
градиента pH, не станет вновь ниже, чем его pi. Продвижение белка с
элюентом снова продолжается до попадания в более щелочную область
грациента. По-
I ПН IIII ¦¦!¦¦¦¦¦
lining
Т±) т±) (c)о(c)
(c)о(c)
1±) ^ (c)о(c)
Рис. 2.29, Фокусирующий эффект при хроматофокусировании. Молекулы,
находящиеся в "хвосте" белковой зоны, "отталкиваются" от обменника и
