Биология развития млекопитающих - Манк М.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка):
покрывала клетки; перемешайте суспензию, осторожно постучав по стенке
пробирки.
4. Добавьте двойной объем фиксатора (метанол : ледяная уксусная кислота,
3:1). Вносите медленно, по стенке пробирки. Энергично, но осторожно
пипетируйте, стараясь разрушить комки клеток. Добавьте фиксатора до 5 мл.
Центрифугируйте 8 мин при 450 g.
102
Глава 4
5. Удалите супернатант. Прибавьте около 5 мл фиксатора и оставьте
суспензию на час при комнатной температуре.
6. Центрифугируйте 8 мин при 450 g.
7. Внесите ~ 1 мл свежеприготовленного фиксатора. (Добавляйте фиксатор,
пока суспензия слегка не помутнеет.)
8. Дайте клеточным сгусткам осесть на дно. Сделайте пробный препарат,
высушив на воздухе каплю суспензии на предметном стекле. Просмотрите в
фазово-жонтрастном микроскопе и, если суспензия слишком разведена, снова
отцентрифугируйте и отбросьте часть фиксатора. Ресус-пендируйте.
2.3. Рутинная окраска
Для рутинного окрашивания препаратов рекомендуется свежеприготовленный
краситель Гимза (если используется Gurr "R66", нужно к 1 мл добавить до
40 мл буфера с pH 6,8, приготовленного с помощью буферных таблеток Gurr).
Окрашивайте 5 мин в сосуде Коплина.
В нашей лаборатории с успехом применяется окрашивание карболовым фуксином
[4].
Раствор А: основной фуксин 3 г
70%-ный этанол 100 мл
Раствор Б: раствор А 10 мл
5%'Чный фенол 90 мл
Краситель: раствор Б 45 мл
ледяная уксусная кислота 6 мл
37%-ный формальдегид 6 мл
Окрашивание срезов свежеприготовленным красителем за-
нимает не менее 30 мин, но по мере хранения краситель "созревает" и время
окрашивания укорачивается. Карболовый фуксин особенно уместен при
радиоавтографии: он не взаимодействует с эмульсией и не смывается в
проявителе. Следовательно, можно окрашивать клетки до нанесения эмульсии,
например в экспериментах по гибридизации in situ. На рис. 4.1
представлены препараты клеток, полученных при биопсии семенника человека
на стадиях сперматогониального митоза, MI и MII. Препараты высушивали на
воздухе и красили карболовым фуксином. Среди хромосом MI четко выделяется
похожий на цепочку бивалент XY. Аутосомальные биваленты могут быть
расположены в порядке их размера, но идентификация хромосом в бивалентах
невозможна. В МП можно узнать хромосому 9 по вытянутой области в длинном
плече, соответствующей вторичной перетяжке. Мышиные хромосомы в МП
представлены на рис. 4,1, Г.
Анализ мейоза в половых клетках человека и мыши
103
, ^ <5 О
f 00 ** | O'
Л V /I/ '
lr
:f* Г "* ¦"Ъ7К^<:>Г
^4>v ' Ar.V? '
¦ v * 4
i * Jf*_ * М."
.v ; *T r.f . ¦ J. ' /
,;Л' ' i
Рис. 4.1. Высушенные на воздухе метафазы клеток из суспензии семенников
человека и мыши (окрашены карболовым фуксином).
4. .Митоз в сперматогонии человека. Б. Мейотическая стадия Ml у
человека (стрелка указывает на бивалент XY). В. Мейотическая стадия МП у
человека (отмечена хромосома 9 с характерной вторичной перетяжкой). Г.
Стадия MII у мыши (отмечена хромосома 10).
2.4. С-окраска
С-окраска способствует идентификации мейотических бивалентов. У мыши во
всех хромосомах, кроме Y, С-сегмент расположен вблизи центромеры (см.
также гл. 5, разд. 5.2). На рис. 4.2, Л представлены С-окрашенные
хромосомы мыши (ста--дня MI). Хорошо заметна транслокация Т(14; 16)6 Са.
В Х-хро-чосоме и во всех аутосомах выделяется С-сегментный
гетерохроматин. Для стерильных самцов характерна ассоциация меж-* ду
центромерой Х-хромосомы и транслокационным квадрива-лентом [5J. В Y-
хромосоме четкий С-сегмент не выявляется. Па рис. 4.2,5 представлен С-
окрашенный МН-сперматоциг мыши. Рис. 4.2, В дает представление о том, как
выглядит О-окрашенная MI-клетка человека, гетерозиготного по рецил-рокной
транслокации t(9; 22). Хорошо различаются биваленты
1. 16 и Y, а в квадривалентах (Q) можно видеть крупные С-сегменты
хромосомы 9. Метод выявления С-сегментов в мейозе предложили Чендлей и
Флетчер [6J. Он представляет -обой модификацию методики Самнер [7J. (С-
окрашивание митотических хромосом описано в гл. 5, разд. 5.2.)
104
Глава 4
Рис. 4.2. Сперматоциты, окрашенные С-методом.
А. Стадия Ml в мейозе мыши. Хорошо видна транслокация (14;15)6СА.
Отмечена связь между квадривалентом реципрокнон транслокации (CHIV) и
бивалентом XY. Б. МП нормального самца мыши. В. MI человека,
гетерозиготного по реципрокной транслокацни (9;22). В квадриваленте (Q)
видны четкие С-сегмеиты хромосомы 9. Биваленты 1 и 16, так же как и Y-
хромосому, можно идентифицировать по крупным С-сегментам.
1. Поместите предметные стекла в 0,2 М НС1 при комнатной температуре на 1
час.
2. Сполосните деионизированной водой.
3. Поместите стекла в 5%-ный гидроксид бария при 50°С на 30 сек
(человеческий материал), 4%-яый гидроксид бария при 37 °С на 30 сек
(мышь).
4. Сполосните деионизированной водой.
5. Поместите стекла в стандартный солевой раствор цитрата (2XSSC) при
60°С на 1 час.
6. Сполосните деионизированной водой.
7. Окрашивайте по Гимза в течение 45 мин-1 часа (см. разд. 2,3).
