Биология развития млекопитающих - Манк М.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка):
установленные инъекционную и удерживающую пипетки (разд. 7.1.1) и в
каждую втяните немного среды.
2. Сфокусируйте микроскоп на кусочек донорской ткани и в той же фокальной
плоскости расположите кончик инъекционной пипетки. Очень осторожно
втягивайте клетки в пнпетку, пока они не окажутся на расстоянии 10- 20
мкм от ее кончика. Сильное всасывание может привести к тому, что столбик
парафинового масла диспергируется средой на отдельные капли и
гидравлический контроль будет нарушен.
3. Сфокусируйте эмбрион и поверните его предполагаемым местом инъекции к
концу инъекционной пнпетки. Осторожно присосите эмбрнои удерживающей
пипеткой (рис. 3.10,Л). Приведите инъекционную пнпетку точно в ту же
фокальную плоскость, где находится предполагаемое место инъекции (рис.
3.10, А). Осторожно подталкивая эмбрион концом пипетки, убедитесь в том,
что они располагаются на одной лннин.
4. Пользуясь только рычагом управления, придвиньте инъекционную пипетку к
боку эмбриона н отведите рычаг управления вперед до упора. При помощи
винта, контролирующего движение вперед ("передний контроль"), поставьте
конец инъекционной пипетки на одну лннню с наиболее удаленным краем
амниотической полости (т. е. так, чтобы она, будучи продвинутой рычагом
управления до ее крайнего предела, не проникла в стенку эмбриона на
противоположной стороне) (рис. 3.10,Б).
5. При помощи рычага управления отодвиньте конец пипетки назад в прежнее
положение - к месту предполагаемой инъекции (рис. 3.10,В). Отодвиньте ее
слегка, а затем энергично переведите рычаг управления в его крайнее
положение. Пипетка должна проникнуть в эмбрион в нужном месте и войти в
амниотическую полость (рис. 3.10,Г).
6. Рычагом управления осторожно вытаскивайте пипетку, пока ее конец не
окажется как раз позади места предполагаемой инъекции. Медленно выпустите
клетки в пространство, образовавшееся при выдвигании пипетки (рис. 3.10,
Д). Как только клетки выйдут из пипетки, полностью извлеките инъекционную
пипетку, затем освободите эмбрион и от удерживающей пипетки.
7. Поверните эмбрион и убедитесь, что трансплантат находится в нужном
положении.
8. Перенесите эмбрион в роллерную культуру.
9. В конце периода культивирования зафиксируйте опытные и контрольные
эмбрионы жидкостью Карнуа (60% абсолютного спирта, 30% хлороформа, 10%
уксусной кислоты) и обрабатывайте обычными гистологическими н
радиоавтографическими методами. В каждую партию инъецированных эмбрионов
рекомендуется включать один меченый контроль.
') Состав РВ1 см. в гл. 13, разд. 3.1.1.
такие, как протамин голубой и тушь, или клетки, меченные флуоресцентными
красителями. Процедуру следует повторять до тех пор, пока инъекционная
пипетка не будет безошибочно достигать намеченной зоны. Можно делать
инъекции и "вручную". В этом случае закрепление инъекционной пипетки в
манипуляторе Сингера дает более надежное и точное движение.
Т Г Т г т
Рис. 3.10. Техника инъекции трансплантируемых клеток в 8-дневный эмбрион.
В верхней части схемы показано положение рычага управления при каждом
маневре. Детальное описание процедуры см. в табл. 3.11.
92
Глава 3
Таблица 3.12. Инъекции in utero
1. Чтобы следить за объемом инъецируемой жидкости, рекомендуется
калибровать инъекционную пнпетку (разд. 9) в соответствии с удобными
объемами (т. е. 0,5 мкл). Зная внутренний диаметр стеклянной трубки и
принимая ее за стандартный цилиндр, легко рассчитать длину, занимаемую
данным объемом вдоль невытянутой колонки пипетки, и нанести серию делений
проксимальнее ее суженного конца.
2. Закрепите инъекционную пипетку в инструментальном держателе,
прикрепленном к насосу (de Fonbrune), и заполните ее парафиновым маслом.
3. Анестезируйте беременную мышь (Avertin: 0,1 мл/5 г веса тела)
Поместите ее на предметный столик препаровального микроскопа и осветите
нижнюю брюшную область (рекомендуется осветитель).
4. Сделайте средне-брюшной надрез (около 1,0-1,5 см длиной) через кожу и
стенку тела нижней части живота. Чтобы уменьшить кровотечение, прижгите
ранку, делая разрез очень горячими ножницами.
5. Осторожно извлеките матку через отверстие.
6. Наберите донорские клетки или метящее вещество в инъекционную пипетку,
всасывая достаточное количество среды или метки так, чтобы мениск
парафинового масла находился в пределах калиброванной части пипетки.
Всасывайте осторожно, чтобы масло ие образовало в среде мелких капель.
Закрепите инструментальный держатель на манипуляторе Сингера.
7. Захватите матку пинцетом вблизи децидуальной капсулы зародыша.
Продвиньте инъекционную пипетку так, чтобы ее верхушка расположилась
напротив средней линии децидуальной капсулы, примерно на трети расстояния
до аитимезометриального конца.
8. Сделайте отверстие в мышце матки концом инъекционной иглы от шприца.
Введите инъекционную пипетку через это отверстие в середину де-цидуомы.
9. Следя за движением мениска парафинового масла, инъецируйте ~0,5 мкл в
эмбрион.
10. Извлеките инъекционную пипетку.
