Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Манк М. -> "Биология развития млекопитающих " -> 46

Биология развития млекопитающих - Манк М.

Манк М. Биология развития млекопитающих — М.: Мир, 1990. — 406 c.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка): biologiyarazvitiyamlekopitaushih1990.djvu
Предыдущая << 1 .. 40 41 42 43 44 45 < 46 > 47 48 49 50 51 52 .. 162 >> Следующая

двойных капель фиксатора на восковой пластине (зубной воск или парафин,
застывший на стеклянной поверхности) и опустите каждую сетку на
поверхность капли (1 сетка на каплю, каждую каплю используйте один раз).
В качестве крышек при фиксации используются имеющиеся под рукой маленькие
перевернутые чашки.
9. После фиксации выньте каждую сетку зажимающим антикапиллярным
пинцетом, удалите избыток фиксатора, прикоснувшись краем сетки к
поверхности фиксатора, а затем положите сетку лицевой стороной вниз на
поверхность 0,4%-ного Photoflo (Eastman Kodak, свежеприготовленного на
боратном буфере, pH 8 и профильтрованного перед употреблением). Держите
20-30 сек, осторожно покачивая. Промокните сетку, прикоснувшись к краю
фильтровальной бумаги, просушите под лампой накаливания и поместите на
фильтровальную бумагу в чашку Петри для полного высыхания. Если Photoflo
перейдет на противоположную сторону сетки, возможны артефакты. Сетки
можно окрашивать в любое время после высушивания (некоторые были окрашены
год .спустя).
Анализ мейоза в половых клетках человека и мыши
117
10. Окрашивание. В качестве красителя следует использовать
свежеприготовленную и профильтрованную смесь 4%-ной фосфорновольфрамовой
кислоты (ФВК.) и 95%-ного этанола (1:3). Воспользовавшись антикапил-
лярным пинцетом, поместите сетку лицевой стороной вниз на поверхность
спиртовой ФВК на 1 мин, затем перенесите на поверхность 95%-ного этанола
для ополаскивания в течение 15-30 сек, осушите фильтровальной бумагой и
дайте высохнуть на воздухе. Замечание: следует позаботиться о том, чтобы
ни краситель, ни спирт не затекли на обратную поверхность сетки, иначе в
процессе высушивания поверхностное натяжение может разорвать угольно-
формваровую пленку.
11. Поместите сетки на предметное стекло "лицом" вверх, закройте
покровным стеклом № 1 и смотрите с сухими фазовыми объективами Х20 или
Х40. На препарате хорошо видны распластанные сперматоциты и синаптонемные
комплексы (СК)- Нужные сетки следует быстро отобрать.
12. Для анализа препаратов следует пользоваться малым увеличением ЭМ
(Х250-3000).
Вышеописанный метод был предложен .специально для электронно-
микроскопического анализа СК. Однако, поскольку СК и другие структуры,
такие, как районы ядрышкового организатора (ЯОР) и пластины прикрепления,
видны и на уровне светового микроскопа (СМ) после серебрения, многие
авторы пользуются этой методикой для СМ [40] или последовательно сочетая
исследование в световом микроскопе с электронной микроскопией. Анализ в
СМ занимает мало времени и может быть использован для просмотра стекол и
отбора хороших клеток, которые затем будут изучаться в ЭМ. Один из таких
приемов описан в следующем разделе.
4.2. Распластывание для последовательного анализа в световом и
электронном микроскопах
Процедура, которой мы постоянно пользуемся в нашей лаборатории,
представляет собой модификацию метода Флетчера [40].
4.2.1. Приготовление клеточной суспензии
1. Мышь. Извлеките семенники из белочной оболочки и поместите в среду
F10, обогащенную 20%-ной ЭТС (Gibco Biocult). Измельчите тонкими
ножницами в наклонной стеклянной чашке Петри. Дайте фрагментам канальцев
118
Глава 4
осесть в течение 20 мин. Отсосите суспензию пастеровской пипеткой,
оставив дебрис на дне, и перенесите в коническую центрифужную пробирку.
Центрифугируйте при 150 g в течение 10 мин. Удалите большую часть надоса-
дочной жидкости, оставив количество, достаточное для ресуспендирования
клеток.
2. Сперматоциты человека. Поместите материал тестикулярной биопсии в
среду Дульбекко с фосфатным буфером (PBS) и измельчите ножницами.
Перенесите в колбу и поставьте на магнитную мешалку примерно на 1 час.
Отцентрифугируйте при 150g 10 мин в конической центрифужной пробирке.
Отбросьте супернатант и ресуспенди-руйте клетки в свежем буфере. Трижды
промойте клетки и оставьте в небольшом объеме PBS.
UJ. Распластывание клеток
1. Прежде чем приготовить препараты, предварительно очищенные и вымытые в
спирте стекла покройте 5%-ным раствором пластика Optilux (Falcon) в
хлороформе [42]. Для погружения стекол используйте сосуд Коплина, затем
составьте их ребром на подставку и сушите в беспы-левой атмосфере.
Высушив, прикрепите пластиковое покрытие к краям стекол резиновым клеем
Holdtite.
2. Распылите из пульверизатора черную краску "DEXION" на 50-мм часовые
стекла для создания водоотталкивающей поверхности. Подойдет и другая
краска, дающая темный фон и водоотталкивающую поверхность.
3. Наполните черное часовое стекло свежеприготовленным и профильтрованным
раствором 0,2 М сахарозы; мениск раствора должен выступать над краем
часового стекла (6-7 мл).
4. Втяните небольшое количество клеточной суспензии в длинную
пастеровскую пипетку и дайте одной капле (примерно 0,02 мл) свеситься с
конца. Осторожно прикоснитесь этой каплей к поверхности распластывающего
раствора. Процесс можно контролировать в стереомикроскопе под малым
увеличением, но в этом нет большой необходимости, так как распластывание
Предыдущая << 1 .. 40 41 42 43 44 45 < 46 > 47 48 49 50 51 52 .. 162 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed