Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Манк М. -> "Биология развития млекопитающих " -> 44

Биология развития млекопитающих - Манк М.

Манк М. Биология развития млекопитающих — М.: Мир, 1990. — 406 c.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка): biologiyarazvitiyamlekopitaushih1990.djvu
Предыдущая << 1 .. 38 39 40 41 42 43 < 44 > 45 46 47 48 49 50 .. 162 >> Следующая

для органной культуры (Falcon ЗОЮ) и культивируйте под стерильным
парафиновым маслом {1 мл BDH) при 37°С в СОг-инкубаторе (5% ССЬ) с
высокой влажностью. Через 5 ч яйца вступят в MI и через 17 ч -в MII.
5. Промойте яйца дважды и оставьте на 20 мин в свежем 1%-ном растворе
цитрата натрия при комнатной температуре. Нанесите микрокаплю 1%-ного
цитрата натрия с яйцом на обезжиренное стекло, воспользовавшись тонкой
пипеткой. На обратной стороне стекла отметьте место кружком.
6. Фиксируйте по Тарковскому [30] (процедура также описана в гл. 5, разд.
4 этого руководства). Из другой тонкой пипетки, установив ее конец точно
над поверхностью капли с яйцом, нанесите несколько капель фиксатора
(метанол : ледяная уксусная кислота, 3:1). Оптимальное число капель
фиксатора - три.
112
Глава 4
7. Окрашивайте 5 мин 2%-ным раствором Гимза или другим рутинным
красителем (см. разд. 2.3) или используйте С-окраску, как описано в разд.
2.4.
Другой метод культивирования яиц до стадии MI и фиксации описан Кемигучн
[31], модификация для мыши предложена Сугавара и Микамо [32]. Эта техника
предполагает более медленную фиксацию, что снижает возможность потери
хромосом.
1. Вырежьте яичники между 12.00 и 18.00 ч диэструса, т. е. в середине
астрального цикла, что контролируется осмотром вагины. Поместите их на
часовое стекло с раствором Хэнкса и соберите яйца из крупных фолликулов,
прокалывая их острой иглой.
2. Удалите прикрепившиеся клетки кумулюса, пипетируя тонко оттянутой
пипеткой.
3. Яйца с четким зародышевым пузырьком культивируйте в 1 мл среды 3,5-6 ч
при 37 °С в атмосфере с 5% СО2. В качестве культуральной среды следует
использовать смесь, состоящую из 85% ТС199 (Gibco Biocult) и 15% ЭТС. В
этой среде 72% яиц достигает MI.
4. Для получения яиц в MII требуется более длительный период
культивирования (см. выше). Но они могут быть извлечены и из яйцеводов
после овуляции (см. разд. 3.3).
5. Инкубируйте яйца мыши с 0,02%-ной проназой (Sigma) в течение 15-20 сек
для размягчения блестящей оболочки.
6. Обработайте двумя гипотоническими растворами: сначала 40%-ной ЭТС 10
мин, затем 1%-ным цитратом натрия 40 мин, в обоих случаях при 37 °С.
7. Осторожно перенесите яйца с небольшим количеством раствора 1%-ного
цитрата натрия в смесь абсолютный метанол : ледяная уксусная кислота :
дистиллированная вода (5:1:4). Это воздействие растворяет оболочку и ща-
дяще фиксирует яйца. Вплоть до этого этапа чашку или часовое стекло
следует менять при каждой смене раствора. Все этапы контролируют под
микроскопом.
8. Спустя 5 мин после помещения яиц в указанный выше раствор втяните одно
из них вместе с небольшим объемом фиксирующего раствора в шпеманновскую
пипетку с тонким концом и перенесите на обезжиренное стекло в кружок
(маркированный с обратной стороны). После растекания фиксатора яйцо
приклеится к стеклу недалеко от кончика пипетки.
9. Немедленно вслед за этим еще раз фиксируйте яйцо раствором Карнуа.
Анализ мейоза в половых клетках человека и мыши
113
10. Поместите стекло в сосуд Коплина с тем же фиксатором и оставьте по
меньшей мере на 20 мин.
11. Погрузите стекло в смесь абсолютный метанол: ледяная уксусная
кислота: дистиллированная вода (3:3:1) на 1 мин. Это способствует
уплощению яиц прн высушивании.
12. Очень медленно извлеките стекло и высушите его воздухом, увлажненным
прохождением через воду при 37 °С.
13. Окрашивайте по Гимза (разд. 2.3) или С-методом (разд. 2.4).
Препараты, приготовленные по этой методике, демонстрируют лучшее
распластывание и сохранность хромосом [32], чем полученные любым другим
из упомянутых способов, включая и по Тарковскому [30].
3.3. Препараты ооцитов в МП после овуляции
Сбору яиц в MI и MII предшествует стимуляция мейоза гормональной
инъекцией самки (гл. 1, разд. 5.4). Ооциты в MI следует собрать из
овариальных фолликулов спустя определенное время после введения
фолликулостимулирующего гормона гонадотропина сыворотки жеребой кобылы
(ГСЖК) и человеческого хориогонадотропина (чХГ). Ооциты в МИ извлекают из
ампул фаллопиевых труб после овуляции. Соответствующая методика для мыши
описана Рёборном и Хэнсманом [22].
1. Инъецируйте 2,5 ME ГСЖК и через 48 ч 2,0 ME чХГ внутрибрюшинно.
2. Извлеките ооциты в MI из зрелых фолликулов через 5 ч после чХГ, как
описано в разд. 3.2.
3. Соберите ооциты в МИ через 15 ч после инъекции чХГ из ампул
фаллопиевых труб (см. гл. 2, разд. 2.1). Используйте для этого среду,
предварительно нагретую до 37°С.
4. Обработайте клетки кумулюса, окружающие яйцо в МП, гиалуронидазой 100
МЕ/мл (тип III, Sigma), в течение 2-5 мин (см. гл. 2, разд. 2.1).
Дальше продолжайте с п. 5 методики, описанной в разд. 3.2 для
препарирования и окрашивания хромосом [29].
Яйцо мыши в МИ после С-окраски представлено на рис. 4.7. Применение этого
способа окраски в большой степени способствует точному подсчету хромосом
МИ, что необходимо, например, при изучении анеуплоидии.
Процедура, стимулирующая суперовуляцию у человека, описана Ягелло [34], а
Предыдущая << 1 .. 38 39 40 41 42 43 < 44 > 45 46 47 48 49 50 .. 162 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed