Биология развития млекопитающих - Манк М.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка):
его в минимальном количестве. Например, для эффективного мечения всех
клеток эпибласта эмбриона на стадии поздней первичной полости достаточно
приблизительно 2ХЮ~3 мкл раствора АЭП - ПХ в концентрации 1 мг/мл, при
этом метка останется различимой в течение 24 ч культивирования.
Приготовив раствор метки, поместите его каплю в манипуляционную камеру
или чашку на достаточном расстоянии от капли среды, в которой
предполагается проводить инъекцию (следите чтобы капли не слились, когда
будете переносить пипетку из одной капли в другую).
7.2.2. Клетки
Для выявления инъецированных донорских клеток в окружающей ткани хозяина
можно использовать генетические маркеры. Однако в настоящее время
подходящие для этого маркеры не подобраны.
Наиболее приемлемым является интенсивное мечение [3Н]-тимидином.
Благодаря короткому митотическому циклу клеток раннего
постимплантационного зародыша он быстро включается в большинство клеток и
не нарушает хода развития [25J. Процедура мечения клеток [3Н]-тимидином
описана в табл. 3.10. На рис. 3.9 представлены радиоавтографы включения и
меченый контроль, а также две инъецированные химеры.
7.3. Инъекция
Процедура инъекции одинакова для растворов и для клеток, поэтому мы
ограничимся описанием инъекции клеток (табл. 3.11 и рис. 3.10). При
введении растворов необходимо помнить, что удерживающей пипеткой нельзя
дотрагиваться до капли с меткой. Каждая манипуляционная капля должна
содержать только один эмбрион и для каждой инъекции нужно брать свежую
каплю. Введение материала в мезодерму или эктодерму требует прохождения
через энтодермальный слой. При инъекции клеток это не имеет особого
значения, между тем раствор может попасть не по назначению. Чтобы решить
эту проблему, необходимо тщательно продумать путь инъекции, например
вводить в амниотическую полость через внезародышевую область.
88
Глава 3
Таблица ЗЛО. Приготовление для инъекции клеток, меченных [3Н]-тимидином
1. Внесите 10 мкКи/мл [3Н]- тимидина (с удельной активностью 10,5 Ки/мМ)
в модифицированную среду Игла (Flow Laboratories). Выдержите среду в
атмосфере с 5% СОг при 37 °С.
2. Интактные эмбрионы с неповрежденной оболочкой Рейхерта инкубируйте в
среде не меиее двух часов. Этого срока достаточно, чтобы пометалось 90%
клеток зародыша на стадии поздней первичной полоски, но эмбрионы старшего
возраста требуют более длительного времени инкубации, которое
определяется приготовлением контрольных срезов (контроль включения, рис.
3.9, А).
3. Промойте эмбрионы, трижды сменив РВ1 ¦>+10% ЭТС+10 мкл/мл 10-3 М
тимидина. Немеченый тимиднн в этой концентрации (10_3М) должен
присутствовать во всех средах при всех дальнейших манипуляциях и
культивировании.
4. Поместите 2-3 меченых эмбриона в роллерную культуру (меченый контроль)
(рис. 3.7). Присутствие таких эмбрионов в каждом опыте позволяет
проконтролировать все варианты мечения, разбавления метки и радиоавто-
п)афнческой процедуры (рис. 3.9,Б).
5. Отделите нужную для инъекции ткань или область эмбриона, как описано в
разд. 4.
6. Разрежьте ткань стеклянными иглами на фрагменты и перенесите эти
кусочки в манипуляционную каплю, готовую для проведения в ней инъекции в
рецнпиентный эмбрион.
3) Состав РВ1 см. в гл. 13, разд. 3.1.1.
8. Введение клеток или метки в эмбрионы in vivo
Более 10 лет тому назад было предложено несколько удачных способов
введения клеток или вирусов в эмбрион in utero [30-32]. Преимущество
этого подхода очевидно: он позволяет получить эмбрион любой из
последующих стадий развития и взрослых химер. Наиболее впечатляющий
пример - недавнее сообщение о жизнеспособности мыши с четкой химерностью
по меланоцитам, что явилось результатом инъекции клеток нервного гребня
пигментированного донора альбиносному эмбриону in utero [13]. Недостаток
метода введения клеток в эмбрион in vivo заключается в невозможности
точно локализовать место инъекции, а также в том, что в результате
инъекций в висцеральный желточный мешок или амниотическую полость лишь
ограниченное число клеточных типов может войти в состав
постимплантационного эмбриона. Более того, химерные эмбрионы не удается
получить при инъецировании до середины 9-го дня беременности. Возможно,
эмбрионы ранних стадий физически еще слишком малы или слишком
чувствительны к инъекциям. Прежде чем приступить к получению химер,
следует попрактиковаться в проведении инъекций (табл. 3.12), используя
для этого хорошо идентифицируемые растворы или суспензии,
Рис. 3.9. Радиоавтографы контрольных н экспериментальных эмбрионов. А.
Контроль поглощения. Б. Меченый контроль. В. Инъецированный эмбрион,
химерный в области первичной полоски. Г. Инъецированный эмбрион, химерный
в области нотохорда и кишки.
90
Глава 3
Таблица 3.11. Инъекция клеток в эпнбласт 8-дневного эмбриона
1. Поместите один или более эмбрионов, подлежащих инъецированию, а также
донорские клетки в манипуляционную каплю РВ1'>-1-10% ЭТС+ + 10~5 М
"холодного" тнмнднна. Введите в то же поле зрения предварительно
