Биология развития млекопитающих - Манк М.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка):
8. Сполосните деионизированной водой, хорошо просушите в течение
нескольких минут, проведите через ксилол п заключайте в бальзам.
Анализ мейоза в половых клетках человека и мыши
10е.
' 2.5. Q-окраска
Флуоресцентное окрашивание оказалось неинформативным для анализа мейоза у
мыши, однако этот же метод при изучении человеческого материала
способствовал выявлению нефлуоресцирующего короткого плеча Y-хромосомы,
спаренного с Х-хромосомой в метафазе I мейоза [8]. Применение
флуоресцирующего АТ-специфнческого антибиотика дистамицина А в сочетании
с АТ-специфическим красителем 4',6'-диамидино-2-фе-нплиндолом (ДАФИ)
продемонстрировало у мейотических бивалентов человека яркое свечение
хромосомных районов, содержащих структурный гетерохроматин [9J.
Флуоресценция обнаруживается в парах хромосом 1, 9, 16 и Y-рсромосоме, а
иногда и в биваленте 15 (рис. 4.3). Техника окрашивания заключается в
следующем.
1. Нанесите на стекло раствор дистамицина A (Sigma) (0,1-0,2 мг/мл в
буфере Мак-Илвина: лимонная кислота- Na2HP04, pH 7,0), накройте покровным
стеклом. Инкубируйте при комнатной температуре 15 мин в темноте, во
влажной камере.
2. Смойте покровное стекло струей деионизированной воды.
3. Нанесите одну большую каплю раствора ДАФИ (Sigma) (0,2-0,4 г/мл в
буфере Мак-Илвина, pH 7,0) и опустите на каплю свежее покровное стекло.
Поместите предметное стекло во влажную камеру на 30 мин.
4. Смойте струей деионизированной воды.
5. Нанесите 2 капли буфера МакчИлвина.
6. Очень осторожно промакните фильтровальной бумагой.
7. Зафиксируйте границы покровного стекла раствором каучука (Holdtite).
Дистамицин А теряет стабильность в водном растворе, поэтому такой раствор
хранить не рекомендуется. Окрашенные препараты при первом просмотре могут
обесцветиться. Для стабилизации их необходимо примерно в течение дня
хранить при температуре 4 °С в темноте.
2.6. Картирование пахитенных хромосом
Для получения качественных препаратов пахитенных хромосом, которые могут
быть использованы при картировании индивидуальных бивалентов, была
предложена специальная методика воздушного высушивания с длительным
гипотоническим воздействием при комнатной температуре или с более кратким
гипотоническим воздействием при повышенных температурах [10-13]. На
стадии поздней пахитены в каждом биваленте становятся заметными линейно
расположенные компактизиро-
106
Глава 4
S3
Рис. 4.3. Препараты MI мейоза у человека, окрашенные последовательно
карболовым фуксином (А) и ДА/ДАФИ (Б). Флуоресценция позволяет
идентифицировать биваленты 1, 9, 15, 16 и Y-хромосому. Бивалент XY
отмечен
стрелкой (на А).
ванные районы хроматина, или "хромомеры". Их число, размер и
последовательность для каждой хромосомы постоянны. Обнаружено
поразительное соответствие в расположении хромомер и митотических G-
сегментов. Кроме того, С-окраска дает возможность локализовать положение
центромеры. Все это способствовало созданию пахитенных хромосомных карт
человека
Анализ мейоза в половых клетках человека и мыши
107
Рис. 4.4. Человеческий сперматоцит иа стадии пахитены; каждый из 22 ауто-
сомных бивалентов идентифицируется на основании паттерна хромомер (А) и
положения центромеры (Б). Я- ядрышко; ПП-половой пузырек. (Из работы
[12], воспроизводится с разрешения.)
[12] и мыши [13] (рис. 4.4). Методика, используемая для приготовления
препаратов пахитенных клеток человека, разработана Лучиани [12].
108
Глава 4
1. Погрузите фрагменты семенника в 10 мл 0,88%-ного К.С1 и инкубируйте
при комнатной температуре в течение 8-10 ч.
2. Перенесите в фиксатор метанол: ледяная уксусная кислота (3:1) и
оставьте на ночь при комнатной температуре.
3. На следующий день измельчите фрагменты в фиксаторе.
4. Перенесите пипеткой клеточную суспензию в коническую виалу и
центрифугируйте 7 мин при 150
5. Ресуспендируйте сгусток в 5 мл 45%-ной ледяной уксусной кислоты, затем
немедленно отцентрифугируйте при 150g 5 мин.
6. Сделайте препараты, нанеся капли суспензии из пастеровской пипетки на
чистые, предварительно охлажденные стекла и осторожно высушите над слабым
пламенем газовой горелки.
7. Окрасьте раствором Гимза с фосфатным буфером (pH 6,8) (см. разд. 2.3).
8. Чтобы выявить центромеры, удалите краситель Гимза метанолом и
поместите стекла в 1 М НС1 на 5 мин при комнатной температуре. Промойте в
воде и обработайте 5%-ным раствором гидроксида бария (3 мин при 58°С).
После промывания поместите стекла на 20 мин в 2XSSC при 58 °С и доведите
pH до 7,0. Снова сполосните стекла и окрасьте по Гимза.
Для демонстрации рисунка расположения хромомер одни и те же клетки должны
быть сфотографированы дважды: после этапа 7 и после завершения этапа 8.
Другой способ препарирования пахитенных хромосом - воздействие
гипотоническим раствором КС1 в течение 1 ч при 37 °С - описан для
человека Хангерфордом [10], а для мыши - Фэнгом и Ягелло [13]. Полученные
по этой методике препараты после окраски по Гимза позволяют разглядеть в
