Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
’) A-MuLV — вирус лейкоза Абельсона мышей.
а) сц— цитоплазматический IgM; slg — поверхностный иммуноглобулин. “) НИ — не исследовали.
176 Глава 10
II. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИГЕННЫХ МАРКЕРОВ
ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ В-КЛЕТОКС ПОМОЩЬЮ
МЕТОДА НЕГАТИВНОГО ОТБОРА
А. Общие требования к методу определения
Первый метод, который мы использовали для определения новых антигенных маркеров дифференцировки В-лимфоцитов, включал в себя ряд этапов, последовательность которых в схематическом виде представлена на рис. 10-1.
Ксеногенная иммунизация животных клонированными популяциями жизнеспособных клеток лимфомы приводит к активации и увеличению числа клеток, способных продуцировать антитела к чужеродным антигенам мышиных лимфом. С помощью соматической гибридизации получают иммортализованные антителосинтезирующие клоны и из них отбирают (тестируя антитела на способность связываться с клетками) только те, которые секретируют антитела против антигенных детерминант клеточных поверхностей. Культуры, которые содержат клетки, продуцирующие МА, клонируют в мягком агаре и подвергают повторному тестированию на способность связываться с клетками большого числа линий, представляющих различные стадии и направления дифференцировки.
В исследованиях применяли ксеногенную иммунизацию, т.е. крыс иммунизировали клетками лимфом мышей, поскольку при внутривидовой иммунизации трудно ожидать образования антител, распознающих клетки этого же вида животных как чужеродные. Для описанных здесь методических подходов антигенным материалом служили пре-В-клеточные лимфомы, однако это не означает, что данные подходы применимы к анализу только таких клеток. И нам, и еще ряду исследователей удавалось успешно использовать другие В-клеточные трансформированные линии для индукции образования антител к детерминантам их плазматических мембран. Клонированные популяции клеток лимфом являются идеальным источником антигенного материала в силу целого ряда причин. 1) Если при ксеногенной иммунизации в качестве антигена используют живые клетки лимфом, то обычно получают сильные ответы, которые легко воспроизводятся. 2) Иммунизация клонированной клеточной популяцией, такой как пре-В- или плазматические клетки, дает возможность «направить» ответ против гомогенного клеточного источника антигена; в нормальных тканях клетки такого типа могут присутствовать в очень малых количествах. 3) Иммунизируя животных и анализируя эффекты иммунизации в соответствии с описанными здесь методиками, можно практически гарантировать получение антител против детерминант клеточ-
Картирование новых антигенов В-лимфоцнтов
177
:Т1олуч*нив МА и ид тестирование1 иа флуоресцентном сортере кгето.с
Внутривенное введение крысам клеток . мышиных пре-В-клеточных лимфом
Через 4 дня
Слияние спленоцитов с клетками миеломы Sp 2/0-Ад 14
/ооооо о /оооооо 'оооооо
Перенос в лунки ('лимитирующие разведения)
Отбор проб надоса-.дочной жидкости-из пунок, содержащих растущие клоны
Скрининг по связыванию с поверхностью клеток
Пре-В-клетки ?)
tr
В-клетки
Клетки, сек- , ^
ретирующие иммуногло- ^ А булины Т-клетки
Стволовые клетки
О
?
Инкубация на льду с клетками, использованными для -
иммунизации; последующая инкубация с меченными ФИТЦ мышиными антителами против иммуноглобулинов крыс
Клонирование гибридов из позитивных луйок в мягком агаре
Анализ на
флуоресцентном
сортере
Рнс. 10-1. Схема, отражающая основные этапы проведения негативного отбора МА.
ных поверхностей, синтезируемых В-лимфоцитами. Если представляет интерес исследовать компоненты внутренних мембран или цитоплазматические белковые молекулы, можно проводить иммунизацию мембранными везикулами или фракциями лизи-рованных клеток. Для последующего скрининга полученных МА необходимо использовать фиксированные клетки или очищенные компоненты соответствующих клеток-мишеней. Однако, поскольку мы стремились получить информацию о субпопуляциях жизнеспособных клеток и исследовать функциональную роль молекул, участвующих в клеточных взаимодействиях, наши основные интересы были сосредоточены на изучении структур, экспрессированных на поверхности клеток.
При получении гибридов соматических клеток основное внимание должно быть обращено на три основные проблемы. Во-первых, это выбор для слияния линии клеток (дефицитной по
12—1278
178 Глава 10
ферменту миеломной клеточной линии), наиболее подходящей для запланированных опытов. Клеточная линия должна характеризоваться высокой эффективностью слияний. Способность давать клоны, стабильно продуцирующие антитела, варьирует от одной линии к другой. Поскольку некоторые линии миелом (например, NSl-Ag4/l) секретируют легкие цепи или целые молекулы IgG, нельзя пренебрегать возможностью, что полученные на их основе гибриды будут продуцировать «смешанные» молекулы иммуноглобулинов. Мы обычно исключали подобную возможность, используя для слияния линии, потерявшие способность секретировать иммуноглобулины. Хорошие результаты были получены с двумя субклонами линии X63-Ag8XBALB/c, описанной в работе Шульмана и др. (Shulman et al., 1978). Клоны Sp 2/0:Ag 14 и FO (Fazekas de St. Groth, Scheidegger, 1980) являются прекрасными партнерами по слиянию, так как они конститутивно не синтезируют иммуноглобулины. Мы считаем, что для получения гибридов, синтезирующих иммуноглобулины крыс, эти миеломные клеточные линии мышей подходят больше, чем соответствующие линии крыс. Эта ситуация может изменяться с появлением большего числа пригодных для слияния линий крысиных миелом. Однако слияние клеток мышей с клетками крыс также дает большое число генетически стабильных продуцирующих антитела гибридных клонов.
