Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
2. В каждую лунку добавляют 2—5-105 жизнеспособных клеток лимфомы (той же клеточной линии, которая использовалась для иммунизации) в 10 мкл буфера для ИФМ (0,5% БСА,
0,02 М азид натрия в ЗФР, pH 7,2). При этом рекомендуется использовать гамильтоновский шприц многократного действия. Осторожно перемешивают содержимое лунок встряхиванием панели на вортексе и помещают ее в ледяную баню на 20— 25 мин.
3. В каждую лунку добавляют 50 мкл буфера для ИФМ. Затем в лунки дополнительно вносят по 25—40 мкл 10%-ного БСА в буфере для ИФМ. Высокая концентрация БСА способствует удалению избытка свободных МА при минимальном числе отмывок. Панель центрифугируют при 250 g 5 мин.
Картирование новых антигенов В-лимфоцитов
183
4. Надосадочную жидкость из каждой лунки удаляют пастеровской пипеткой с тонким кончиком, оттянутым над пламенем газовой горелки. Если панель наклонить под углом примерно 30° и отбирать надосадочную жидкость до тех пор, пока кончик пипетки не достигнет дна V-образной лунки, то в каждой из лунок останется по 5—10 мкл жидкости. В каждую лунку добавляют по 100 мкл буфера для ИФМ и ресуспендируют содержимое лунок с помощью 12-канальной пипетки. Если кончики пипетки промывать после ресуспендирования 3—4 раза ЗФР, то их можно не менять для ресуспендирования содержимого следующего ряда лунок. После ресуспендирования панель дентрифугируют 5 мин при 250 g.
5. Надосадочную жидкость удаляют из лунок, как описано в п. 4, и добавляют в лунки по 25 мкл меченных ФИТЦ мышиных антител против иммуноглобулинов крысы, разбавленных до соответствующего разведения. Если необходимо получить информацию только по связыванию флуоресцентного зонда с жизнеспособными клетками, то к мышиным антителам, меченным ФИТЦ, добавляют иодистый пропидий до конечной концентрации 10 мкг/мл. Мы использовали меченные ФИТЦ мышиные МА против легких каппа-цепей иммуноглобулинов крыс и (или) против Fc-фрагмента иммуноглобулинов крыс в концентрациях 5—10 мкг/мл. Конъюгаты ФИТЦ с МА имеют отношения флуоресцеин : белок в диапазоне 1—3. После добавления меченых антител содержимое лунок ресуспендируют многоканальной пипеткой, как описано в п. 4. Панель инкубируют в ледяной бане 20—25 мин.
6. Повторяют процедуры, описанные в п. 3 и 4.
7. Ресуспендируют содержимое каждой лунки в 150 мкл буфера для ИФМ и переносят суспензию в пробирку (Falcon 2052) для подачи образца на ПФКС. Каждую лунку промывают дополнительно 150 мкл буфера.
8. Клетки (5-103—104 клеток на тестируемую пробу культуральной жидкости) анализируют на ПФКС и на основании полученных результатов идентифицируют те гибридные клоны, культуральные жидкости которых содержат антитела к антигенам клеточной поверхности. Методика работы на ПФКС и условия анализа описаны Лейзерсоном в гл. 20. Слабопозитивные клоны можно подвергнуть повторному анализу после того, как удастся сконцентрировать соответствующие культуральные жидкости.
9. Все позитивные культуры можно нарастить до объема 1 мл. Можно также накопить необходимое количество культуральной жидкости для того, чтобы исследовать связывание продуцируемых антител с набором клеточных линий, представляющих различные стадии дифференцировки линии В-лимфоцитов,
184 Глава 10
а также с клетками других линий (табл. 10-1). Этот анализ можно проводить одновременно с клонированием всех позитивных культур для селекции клонов, продуцирующих антитела, специфичные к определенным субпопуляциям лимфоидных клеток.
Г. Клонирование гибридов, секретирующих МА
1. Готовят 100 мл 0,2%-ной суспензии бактоагара (Difco, Детройт, США) в среде МСИД без добавления сыворотки. Эту суспензию доводят до кипения в небольшом культуральном флаконе и кипятят 20—30 мин. Затем плотно завинчивают пробку и охлаждают суспензию в водяной бане до ~45°С.
2. Аликвоту суспензии гибридных клеток, позитивных по тестам связывания, ресуспендируют в 0,5 мл среды МСИД (5-j-10-103 клеток).
3. Смешивают 2%-ный агар с полной средой МСИД в соотношении 1 : 9. Тщательно перемешивают и разливают этот раствор в 24-луночные панели, добавляя по 1 мл смеси в 10 лунок.
4. В первую лунку, содержащую 1 мл 0,2%-ного агара в культуральной среде, добавляют клеточную суспензию, приготовленную, как описано в п. 2. Содержимое лунки быстро перемешивают пипеткой и переносят 0,5 мл в следующую лунку с последующим перемешиванием. Это повторяют до тех пор, пока в каждой лунке не окажется соответствующая порция клеток. Для удобства можно использовать нагреватель с термо-статируемой платформой, для того чтобы панель и ее содержимое имели достаточно высокую температуру, препятствующую загустеванию агара.
5. Панель помещают в инкубатор с влажной атмосферой при 37 °С, куда подается С02 в соответствующей концентрации (обычно 5% С02). Культуры с агаром затвердевают через несколько минут, и в течение нескольких дней их можно не трогать.
6. Если клетки, растущие в агаре, необходимо подкормить, то в лунку по стенке наливают медленно 0,5 мл среды МСИД. Через 5—6 дней при малом увеличении в микроскопе должны быть видны хорошо различимые колонии клеток, а через 10— 14 дней эти колонии должны быть заметны и невооруженным глазом.
