Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
V. ИНГИБИРОВАНИЕ ГАПТЕНАМИ И СВЯЗЫВАНИЕ
ГАПТЕНОВ
Более точную информацию об антигенных детерминантах можно получить при исследовании ингибирования связывания антител в твердофазном РИА гаптенами при наличии гаптенов определенной структуры. Как уже было отмечено, большинство антител против углеводных компонентов клеточной поверхности связывается с три- или тетрасахаридной последовательностью углеводной части гликолипидов или гликопротеинов. Отсюда следует, что в качестве гаптенов нужно иметь три- и тетрасахариды определенной структуры. В настоящее время для исследователей доступно только очень ограниченное число олигосахаридов с известной структурой. Эти олигосахариды или выделяют из молока (Kobata, 1972), или получают синтетическим путем (Chembiomed Ltd. Co., Edmonton, Alberta, Канада; Sokerbolaget, Arlov, Швеция). Антитела разводят так, чтобы связывание составляло 50—75% максимального, и смешивают их с серийными разведениями гаптена. Концентрация гаптена, необходимая для ингибирования связывания антител, относительно
166 Глава 9
высока и составляет около 1 мМ (рис. 9-2). Это обусловлено, вероятно, тем, что равновесие смещено в сторону связывания антител с антигеном, иммобилизованным на носителе, а не в сторону связывания с моновалентным гаптеном. В тесте связывания гаптенов можно также применять меченные 3Н олигосахариды (Smith et al., 1981). Гаптены с высокой удельной активностью легко получить при восстановлении свободных олигосахаридов NaB3H4. Можно также метить смеси олигосахаридов,
100
75-
ш
X
X
го
g 50-
О.
S
ю
I 25-
0-
0.062 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 ' 16
Концентрация гагтена, мМ
Рис. 9-2. Изучение с помощью твердофазного РИА связывания моноклональных антител 29 с очищенным препаратом гликолипида ЛНФП III (лакто-N-фукопентозил-111-церамида, или антигена Lex). В качестве гаптенов использовали следующие олигосахариды из материнского молока человека; ЛНФ III (лакто-М-фукопентоза III); ЛНФ II (лакто-М-фукопентоза II); ЛНД (лакто-N-дифукогексоза I); ЛНФ I (лакто-М-фукопентоза I); ЛНТ (лакто-К-тетроза).
отщепленные от гликопротеинов в результате fj-элиминации или расщепления эндогликозидазой Н. Мы используем модификацию обычного метода, в которой первым шагом является иммобилизация очищенных антител (за счет неспецифической адсорбции) в лунках панелей для микротитрования. После блокирования с помощью БСА (буфер А) остаточной неспецифической адсорбционной способности полимера в лунки вносят меченные 3Н олигосахариды (удельная активность 2 Ки/ммоль) в концентрации ~ 107 расп./(мин-мл) в том же буфере. После инкубации в течение ночи несвязанный гаптен отмывают, лунки еще раз промывают, элюируют связанный с антителами гаптен 5%-ным аммиаком и определяют его количество в сцинтил-ляционном счетчике. Элюированный гаптен можно охарактеризовать с помощью хроматографии на бумаге или гель-проника-ющей хроматографии (Yamashita et al., 1982).
Обнаружение гликолипидных антигенов
167
VI. ТОНКОСЛОЙНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
А. Принцип метода
Тонкослойная хроматография (ТСХ) на покрытых слоем силикагеля пластинах является весьма эффективным методом анализа сложных смесей липидов. Проходящий через носитель элю-ент переносит отдельные липиды с разной скоростью в зависимости от их полярности, в результате чего липидные компоненты оказываются на разных расстояниях от места нанесения. Неполярные нейтральные липиды перемещаются почти с фронтом растворителя, в то время как полярные липиды задерживаются в соответствии с увеличением заряда и степени полярности. Соответствующие липидам фракции можно увидеть после обработки пластины парами йода или опрыскивания специальными окрашивающими реагентами.
Для изучения гликолипидных антигенов чрезвычайно полезным оказался впервые описанный Маньяни и соавторами (Mag-nani et al., 1980) элегантный метод, представляющий собой комбинацию ТСХ и РИА. При использовании этого метода хроматограмму сначала инкубируют с моноклональными антителами, а затем с меченными 1251 антителами против IgG мыши. Обладающие антигенной активностью липиды выявляют с помощью радиоавтографии отмытой и высушенной хроматограммы (рис. 9-3). В сходном методе (Towb,in et al., 1984) липиды переносят блоттингом с хроматограммы на нитроцеллюлозный фильтр, который затем обрабатывают антителами таким же образом. С помощью этого метода можно выявлять антигены в количестве до нескольких нанограммов, т. е. его чувствительность на два порядка выше чувствительности, достигаемой при химическом детектировании с использованием паров иода и красящих реагентов. Не все виды покрытых силикагелем пластин для ТСХ одинаково пригодны для иммунологического выявления липидов. Слой силикагеля должен быть достаточно прочно связан с подложкой и не должен сходить с неё при обработке пластины водными буферными растворами.
