Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
Для насыщения поверхности одной лунки поливинилхлоридной панели достаточно 20 нг чистого гликолипидного или около 100 нг фосфолипидного антигена. Опыты с мечеными липидами показывают, что после серии инкубаций и отмывок с твердой фазой остается связанной только небольшая доля вносимого исходно в лунки липидного материала. Липиды, по-видимому, сорбируются на поверхности полимера за счет гидрофобных взаимодействий, так как их связывание весьма чувствительно к действию неионных детергентов, которые практически не влияют на связывание белков с поливинилхлоридом. Вследствие этого к антителам или отмывочным растворам нельзя добавлять детергенты, что обычно делают для снижения фона. Хотя для большинства моноклональных антител характерен низкий фон в системах без детергентов, около 5% моноклональных антител (по данным анализа большого числа клонов) неспецифически связываются с поверхностью поливиниловых панелей. Эти «прилипшие» антитела могут давать ложноположительные реакции. Проблему фона пытаются решить с помощью свободного от липидов бычьего сывороточного альбумина (БСА), однако лучше всего ставить контроль на неспецифическое связывание в лунках без липидного антигена.
Очень важно выяснить, является антиген глико- или фосфолипидом. Эти типы липидов можно различать по их способности вступать в реакцию с перйодатом или с гидроксидом натрия. Данный тест можно совместить с РИА, внося на 30 мин перед обработкой БСА в покрытые антигеном лунки 25 мМ водный раствор перйодата натрия. При такой обработке углеводная часть гликолипидов быстро окисляется и разрушается, вследствие чего они теряют способность связывать антитела, специфичные к их углеводному компоненту. Тот же тест может быть проведен и на гликопротеинах и гликолипидах после их адсорбции на поверхности лунок микротитрационных панелей. Фосфоли-пидные антигены, кроме фосфатидилглицерола и фосфатидили-нозитола, не меняют своих свойств при обработке перйодатом натрия в этих условиях. Эти антигены разрушаются при инкубации в лунках с 1 М NaOH в течение 30 мин при 37 °С.
На этой стадии возможен также ферментативный гидролиз иммобилизованных на панелях антигенов. Но результаты этой обработки зависят от типа антигена и наличия чистых ферментов с соответствующей специфичностью. Например, нейрамини-даза отщепляет терминальную сиаловую кислоту от углеводного компонента. Утрата антигенных свойств после обработки
11*
164 Глава 9
Время инкубации с нейраминидазой, мин
Рис. 9-1. Изучение с помощью твердофазного РИА связывания антител с верхней фазой липидного экстракта клеток карциномы толстой кишки SW1116. Каждый кружок соответствует одной лунке микротитрационной панели. Лунки покрывают антигеном, как описано в тексте, а затем проводят инкубацию сорбированного материала с нейраминидазой из V. cholerae (0,05 ед./мл) в 0,1 М ацетате натрия, 1 мМ СаС12, pH 5,5, при 37 °С. После инкубации содержимое лунок выливают: лункн промывают буфером А и проводят тест, как описано в тексте. Светлые кружки — связывание моноклональных антител 19-9, взаимодействующих с ганглиозидным антигеном; темные кружки—связывание моноклональных антител 10, специфичных к нейтральному гликолипиду.
нейраминидазой гликолипида или гликопротеина (рис. 9-1) свидетельствует о том, что они несут сиалоглнкозилированные детерминанты. Следует, правда, помнить, что бактериальные нейраминидазы строго специфичны и действуют только на сиа-ловые кислоты определенного типа.
Б. Материалы
96-луночные круглодонные панели для микротитрования из поливинилхлорида (Dynatech, Alexandria, США)
Этанол
Буфер А: 1%-ный БСА, 0,1%-ный азид натрия в ЗФР Меченные 1251 козьи антитела против мышиных IgM или антитела против мышиных IgG (Kirkegaard, Perry, Gaithersburg» США), меченные реактивом Iodogen (Pierce, Rockford, IL) и Na 125I (Amersham) по методу Фрэкера и Спека (Fraker, Speck, 1978).
Обнаружение гликолипидных антигенов
163
В. Процедура определения
Панель для микротитрования промывают этанолом и высушивают. 20 мкл или одну каплю верхней фазы липидного экстракта (что эквивалентно примерно 10е клеток или 1 мг ткани) вносят в одну лунку панели и высушивают в течение ночи под вакуумом. В случае использования растворов чистого гликолипида (1 мкг/мл) или фосфолипида (5 мкг/мл) в метаноле или этаноле их высушивают в лунках в течение 30 мин под вакуумом, создаваемым с помощью водоструйного насоса. Высушенные лунки заполняют буфером А и панели инкубируют в течение 2 ч при 4 °С. Раствор отсасывают из лунок с помощью пластмассового наконечника для пипетки, соединенного с водоструйным насосом. Затем в лунки вносят по 50 мкл супернатанта гибридом (в исходной концентрации или в оптимальном разведении). После инкубации в течение 3 ч при комнатной температуре содержимое лунок выливают, промывают их один раз буфером А и вносят в лунки по 50 мкл меченных 1251 антител против IgG или IgM мыши, разбавленных буфером А до активности 106 имп/(мин-мл). После инкубации в течение 3 ч при комнатной температуре панель стряхивают на фильтровальную бумагу и 4 раза промывают лунки 0,1%-ным БСА в ЗФР струей из промывочного пластмассового сосуда. Для просчета на гамма-счетчике лунки вырезают из панелей ножницами или раскаленной проволокой.
