Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
Другим экспериментальным этапом, по способу реализации которого в значительной степени различаются отдельные лаборатории, является слияние клеток. Мы продолжаем полагаться на слияние клеток, стимулируемое ПЭГ, которое проводим, как описано ниже. Хотя мы считаем этот метод переноса ДНК от популяции иммунизированных спленоцитов к клеткам миеломы вполне надежным, совершенно очевидно, что со временем слияние клеток с помощью ПЭГ будет вытеснено другими, более совершенными приемами.
Последняя проблема, которую необходимо решить, — это проблема скрининга. Важно иметь надежную методику для простого и точного скрининга культуральных жидкостей отдельных клонов на содержание антител нужной специфичности. Избранный метод (например, РИА, ELISA и т. д.) должен быть чувствительным и должен давать по возможности количественную информацию. Анализ, основанный на связывании флуоресцент-номеченных антител (иммунофлуоресцентный метод, ИФМ), требует наличия ~0,2—1 мкг МА в 25 мкл культуральной жидкости. При этом с его помощью можно определять большинство типов детерминант клеточных поверхностей. Этот метод дает также количественную информацию о среднем числе молекул, экспрессируемых на одной клетке, что является немаловажным преимуществом в случае низкоаффинных МА. Поскольку
Картирование новых антигенов В-лимфоцитов
179
для определения антигенов клеточной поверхности лимфоидных клеток мышей используют крысиные МА, применение непрямого варианта ИФМ с меченными флуоресдеинизотиодианатом (ФИТЦ) мышиными МА против иммуноглобулинов крыс обеспечивает достаточную чувствительность определения; при этом практически не возникает проблем с неспецифическим фоновым связыванием. Связывание с Fc-фрагментом в этой системе не вызывало дополнительных затруднений, если предпринимались меры против образования агрегатов.
ИФМ имеет ряд существенных преимуществ перед цитоток-сическими тестами, ELISA и РИА. Во-первых, с помощью ИФМ можно определять молекулы, присутствующие на клеточных поверхностях с плотностью до нескольких тысяч копий на клетку. Во многих случаях, когда методы ELISA на клеточных поверхностях, цитотоксические тесты или РИА оказываются недостаточно чувствительными, антигены плазматической мембраны удается определить с помощью ИФМ. Во-вторых, при исследовании ИФМ имеется возможность достаточно просто детектировать антитела практически всех классов иммуноглобулинов. Например, в настоящее время имеется несколько видов мышиных МА против каппа-легких цепей иммуноглобулинов крыс. Поскольку от 90 до 95% всех иммуноглобулинов крыс содержат каппа-легкую цепь, эти МА существенно улучшают возможности скрининга. В отличие от этого в цитотоксических тестах желательно, чтобы МА принадлежали к классу IgM, так как при этом фиксация комплемента обеспечивается с наибольшей эффективностью. В-третьих, при проведении ИФМ на проточном флуорометрическом клеточном сортере (ПФКС) для каждого определения связывания антител анализируется большое число клеток. Если для каждого образца имеется возможность просчитывать 5—10-103 клеток, то значительно уменьшается вероятность ошибок.
Сначала все слияния клеток проводят с предельно допустимыми разведениями популяции клеток — продуцентов МА против антигенов клеточных поверхностей. Последующий анализ обычно дает достаточно определенные результаты для того, чтобы можно было отобрать гибридные клоны, представляющие интерес. Этот этап не прост, если учесть, что первичная иммунизация крыс клетками мышиных лимфом требует 200—300 лунок с растущими клонами. Такое количество образцов нетрудно проверить с помощью ИФМ, однако приблизительно 5—20% лунок содержат клоны, продуцирующие МА против неизвестных мембранных компонентов. Поэтому следует проводить и негативный отбор, чтобы отбраковать клоны, которые секрети-руют МА к общим для всех клеток поверхностным антигенам. После того как с помощью ИМФ отбирают клоны, позитивные
12*
180 Глава 10
по связыванию с клетками, использованными для иммунизации, необходимо провести их дальнейшее клонирование, чтобы не потерять продуценты потенциально интересных МА. Практически во всех случаях мы использовали клонирование в мягком агаре. Поскольку для этою требуется всего несколько тысяч клеток, можно продолжать растить и анализировать клоны из исходных позитивных лунок, в то время как вторичное клонирование будет идти независимо. Мы создали набор клеточных линий, с помощью которого можно отобрать клоны гибридом, секретирующие МА, специфичные к определенным типам В-лим-фоцитов (табл. 10-1). Эти результаты описаны более подробно в других публикациях (МсКеагп et al., 1984; МсКеагп, Rosenberg, 1985). Секретирующие МА клоны из мягкого агара, отвечающие требованиям процедуры отбора, подвергаются повторной проверке на линии клеток, использованной для иммунизации. После этого аликвоту замораживают и хранят в жидком азоте (Kohler, 1981). Затем нарабатывают большое количество МА для дальнейшего анализа. Обычно этот анализ включает изучение биохимических характеристик антител и их поведения в функциональных тестах лимфоцитов. Для подобных исследований могут потребоваться очищенные или частично очищенные препараты МА. Многие из крысиных МА не связываются с иммуносорбентами на основе белка А, и их аффинная очистка имеет существенные недостатки. Мы рассмотрим воспроизводимый метод фракционирования и очистки МА из бессывороточной культуральной среды в разд. IV.
