Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
Картирование новых антигенов В-лимфоцитов
187
ИЭФ нэг Рн
Кислая Щелочная Кислая Щелочная
з0На зона зона зона
, го 200—
I 'о
- 100-
Рис. 10-2. Сравнение двумерных электрофореграмм, различающихся первым этапом разделения. Суммарный лизат клеток линии 70Z/3 (пре-В-клеточная лимфома), меченный 36S-метионин ом, анализировали, используя для разделения в первом направлении ИЭФ (слева) и НЭГрН (справа). Разделение во втором направлении проводили с помощью электрофореза в 10%-ном ДСН-ПААГ (разделение белков по размеру).
вать молекулы, обладающие специфичностью для данной линии клеток или для определенных стадий дифференцировки.
Для того чтобы убедиться в том, что эти молекулы являются наружными мембранными белками, необходимы дальнейшие эксперименты. С этой целью готовят препараты плазматических мембран из целых клеток, предварительно меченных тотально 355-метионином или меченных по поверхности клеток lz5I с помощью реагента Iodogen (Fraker, Speck, 1978). Меченые белки анализируют методом двумерного гель-электрофореза и элект-рофореграммы поверхностных белков сопоставляют с аналогичными электрофореграммами, полученными для тотальных клеточных лизатов, как описано выше. Таким образом удается установить, какие из молекул — кандидатов на роль маркеров содержатся на плазматической мембране (рис. 10-3).
Б. Техника двумерного электрофореза
Перед биосинтетическим введением метки в суммарный пул клеточных белков (l-f-5) -10® клеток дважды промывали средой RPMI 1640 без метионина. Обычно берут клетки в середине логарифмической фазы роста. Промытые клетки ресуспендиро-вали в 1 мл не содержащей метионина среды RPMI 1640 с 10% СПК и добавляли 200—500 мкКи 355-метионина. Включение
188 Глава 10
г
Щелочная Кислая
pH
Щелочная
зона
Кислая
зона
зона
зона
Г) ре-8-к неточная лимфома 28С9
В-клеточная лимфома WEHI-231
Рис. 10-3. Двумерный электрофоретический анализ суммарных клеточных белков, синтезируемых пре-В- и В-клетками. В первом направлении разделение проводили с помощью НЭГрН. Двумерные электрофореграммы, полученные для пре-В-клеточной лимфомы 28С9 (слева) и В-клеточной лимфомы WEHI-231 (справа), были сопоставлены с аналогичными электрофореграммами для Т-кле-точных и других пре-В- и В-клеточных лимфом. Белки, обнаруживаемые только в лизатах В-клеток, отмечены кружками, а положение фракций, специфичных для Т-клеток, указано стрелками.
метки происходило в течение 4 ч при 37 °С во влажной атмосфере СОг-инкубатора.
Поверхностные компоненты клеток метили 12Б1 по методу Фрэкера и Спека (Fraker, Speck, 1978). 5—10-106 клеток метили
0,5—2 мКи Na12SI в течение 20 мин в ЗФР, приготовленном по Дульбекко, pH 7,2.
Меченые клетки осаждали центрифугированием при 10 000g в течение 5 с в центрифужных пробирках типа 70.702 (Sarstedt). Супернатант удаляли и к клеткам добавляли 100 мкл лизирующего буфера [9 М мочевина, 5%-ный меркаптоэтанол, 2%-ный детергент NP-40 и 2%-ные амфолины, pH 9—11 (LKB)], содержащего свежедобавленный фенилметилсульфонилфторид (ФМСФ 0,1 мМ; хранят в виде 100 мМ раствора в абсолютном этаноле). После ресуспендирования образцы сразу замораживают при —70 °С.
Двумерный электрофорез проводили в соответствии с описанием О’Фаррела (O’Farrel, 1975) для ИЭФ или О’Фаррела и др. (O’Farrel et al., 1977) для НЭГрН со следующими модификациями.
Концентрация полиакриламида в гелях для ИЭФ и НЭГрН составляла 5%. Для разделения во втором направлении ис-
Картирование новых антигенов В-лимфоцитов
189
пользовали 10%-ный полиакриламидный гель. Продолжительность разделения для НЭГрН —1600 В-ч. Эти условия обеспечивают оптимальное разделение белков в диапазоне молекулярных масс от 14 до 150 кДа и изоэлектрических точек от 4 до 8,5.
Фиксированные, отмытые от красителя и высушенные пластины гелей экспонировали с пленкой 5AR (Kodak). Для гелей с белками, меченными 358-метионином, флуорографическое усиление не использовали, так как это приводило к снижению чувствительности и потере разрешения пятен, соответствующих отдельным белкам.
IV. ПРИЛОЖЕНИЕ
В этом разделе мы остановимся на методе приготовления бессывороточной среды для культивирования гибридом, которую можно использовать для препаративного получения МА. Эта среда представляет собой адаптированную для наших целей культуральную среду, описанную Мураками и др. (Murakami et al., 1982). Ее успешно использовали для получения МА, продуцируемых всеми имеющимися в нашем распоряжении линиями гибридом. К последним относятся более чем 30 линий, продуцирующих мышиные и крысиные иммуноглобулины практически всех изотипов. Кроме того, мы использовали эту среду для получения больших количеств культуральной жидкости, содержащей лимфокины. Основное преимущество, которое дает применение этой среды, состоит в замене сыворотки или сывороточных заменителей (например, липидов и альбумина) смесью поддерживающих рост клеток компонентов. Эту смесь легко готовить, и она достаточно дешевая,. Поскольку компоненты смеси, такие как трансферрин, этаноламин, инсулин и селенит натрия, могут заменять сыворотку и поддерживать рост и секрецию продуктов гибридными или трансформированными клетками, упрощается и выделение секретируемых клетками веществ. Вероятно, трансформированные клетки не обладают столь строгими требованиями в отношении присутствия в среде липидов, как нормальные свежевыделенные из организмов кл.етки (Iscove, Melchers, 1978).
