Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
7. Когда число клеток в каждой колонии достигнет 200— 500, можно отбирать из агара клоны; для последующего размножения и анализа клетки хранят в замороженном состоянии. Клоны можно наблюдать в обычный или инвертированный микроскоп в ламинаре. Из культур, содержащих индивидуальные, не слившиеся колонии, можно получать отдельные гибридные
Картирование новых антигенов В-лимфоцитов
185
клоны. Для этого одиночную колонию медленно втягивают в пастеровскую пипетку (эту манипуляцию проводят под микроскопом при малом увеличении). Всасывание клона в пипетку производят с помощью резиновой груши или специально сконструированного механического устройства. Следует избегать всасывания материала через пипетку ртом, так как при этом велика опасность инфицирования клонов микоплазмами.-
8. После отбора отдельной колонии содержимое пипетки, составляющее обычно 100 мкл или меньше, вносят в лунку 96-луночной панели со 100 мкл МСИД.
9. Культуры размножают как можно быстрее с целью получения достаточного для ИФМ объема культуральной жидкости. После повторного тестирования позитивные клоны замораживают в жидком азоте по стандартной методике (Kohler, 1981). Как правило, при повторном тестировании мы выявляем 50% или более позитивных клонов и в каждом случае для замораживания отбираем по три субклона.
III. АНАЛИЗ АНТИГЕННЫХ МАРКЕРОВ
ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ В-КЛЕТОК С ПОМОЩЬЮ ДВУМЕРНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА
А. Цель и схема эксперимента
Наиболее привлекательной чертой исследования препарата клеточных или мембранных белков методом двумерного электрофореза является возможность систематического биохимического анализа большого числа синтезируемых клетками белков. Этот метод позволяет качественно различать до 103 разных белков. При его использовании нас прежде всего интересует возможность идентификации уникальных типов белковых молекул, специфически экспрессируемых В-лимфоцитами на различных стадиях дифференцировки. Мы считаем, что этот метод дает существенные преимущества, которых лишена методика негативной селекции, описанная в разд. II. В данном случае идентификацию уникальных (специфичных для данной стадии дифференцировки) белков можно проводить независимо от их антигенных свойств. Следовательно, хотя и желательно получить МА к таким потенциально маркерным молекулам, совсем не обязательно, чтобы все они обладали иммуногенностью.
Мы начали исследования дифференцировки В-клеток с создания исходной библиотеки карт двумерного электрофореза, получаемых с помощью радиоавтографии биосинтетически меченных 1251 суммарных клеточных белков или белков клеточной поверхности. Были построены карты для нескольких клониро-
186 Глава 10
ванных лимфоидных В-клеточных линий, клетки которых находятся на разных стадиях дифференцировки (от пре-В-клеток до плазматических). Для дальнейшего отбора представляющих интерес белков, были получены аналогичные карты клонированных Т-клеточных линий, которые использовались для сравнительного анализа. Такой подход дает возможность выявить и исключить многие белки, которые являются общими для всех типов лимфоцитов, а также значительно облегчает идентификацию белков, специфичных для определенных стадий дифференцировки, так как карты двумерного электрофореза получают при анализе клонированных популяций, замороженных на определенной стадии процесса дифференцировки. Используя этот подход, мы можем с большей вероятностью идентифицировать белковые маркеры, которые в обычных условиях экспрессируются на немногочисленных субпопуляциях лимфоцитов.
Для получения максимального разрешения биосинтетически меченные лизаты клеток анализировали, применяя два различных метода разделения белков. Хотя оба метода включают фракционирование белков в первом направлении по заряду, при одном из них (изоэлектрическом фокусировании, ИЭФ) белки разделяются в соответствии с их изоэлектрическими точками (pi), а при другом (неравновесном электрофорезе в градиенте pH, НЭГрН) в соответствии с их подвижностью в градиенте pH. При НЭГрН время электрофоретического разделения не достаточно для того, чтобы белки достигли своих значений pi. Поэтому разделение зависит как от суммарного электрического заряда, так и от размера белковой молекулы. Из нашего опыта следует, что НЭГрН дает лучшее разрешение для интересующего нас класса белков. На рис. 10-2 приведены примеры разделения тем и другим методом при исследовании одного и того же меченного 35S клеточного лизата.
Анализ, проводимый для идентификации белков — «кандидатов» на роль стадиеспецифических маркеров, включает двухэтапный отбор данных в соответствии с избранными критериями. Во-первых, белковые карты каждой В-клеточной линии сопоставляют с белковыми картами Т-клеточных лимфом, список которых приведен в табл. 10-1, и выделяют белки, характерные только для В-лимфоцитов. В принципе эти различия выражаются в абсолютном отсутствии соответствующих фракций на электрофореграммах Т-клеток. Возможны и количественные различия в экспрессии белков, которые можно выявить, если имеется разница примерно в пять или более раз. После выявления специфических для В-клеток «кандидатов» на роль маркеров проводят сопоставление белковых профилей пре-В и плазматических клеток и дальнейший поиск маркеров стадий дифференцировки. Подобный анчлиз позволяет идентифициро-
