Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
После осаждения ДНК растворяют в IX ТЭ-буфере, доводят ее концентрацию до 0,02 пмоль/мкл в IX ТЭ-буфере, 15%-ном этаноле и хранят при —20°С.
Е. Циклизация плазмиды с помощью линкера,
содержащего oligo(dG)-концевую последовательность
В реакционной смеси, состав которой приведен ниже, проводят отжиг комплекса кДНК — вектор-затравка и линкера с oligo (dG) -концевой последовательностью.
кДНК — вектор-затравка 15 мкл (~0,3 пмоль) dG-линкер 1 мкл (~0,5 пмоль)
10х Буфер для отжига5 мкл Н2О 29 мкл Всего 50 мкл
Смесь прогревают при 60 СС в течение 5 мин и далее инкубируют при 40 °С 2 ч, а затем разводят: добавляют 50 мкл 10х лигазного буфера Е. coli2), 400 мкл НгО и 7,5 мкл лигазы Е. coli.
•> 10х Буфер для отжига: 0,1 М трис-НС1, pH 7,5; 0,01 М ЭДТА; 1,0 М NaCl.
2) 10Х Лигазный буфер Е. coli: 0,2 М трис-НС1, pH 7,5; 1,0 М КС1; 0,04 М MgCl2; 0,1 М (NH4)2S04; 1 мМ [5-NAD; 500 мкг/мл БСА.
5*
68 Глава 3
Инкубируют при комнатной температуре 30 мин и далее при 15°С 12 ч.
Ж. Синтез второй цепи кДНК путем замещения мРНК
Готовят следующую смесь А:
Смесь четырех dNTP по 12,5 мМ каждого 2,52 мкл 100 мМ P-NAD 1,2 мкл НгО 17,45 мкл
ДНК-полимериза I (35 ед./мкл) 1,33 мкл Всего 22,5 мкл
Добавляют 15 мкл смеси А, 5 мкл лигазы Е. coli (0,4 мкг/ /мкл, 200 ед./мкл, Pubst Labs) и 5 мкл РНКазы Н (1,1 ед./мкл, Pubst Labs) к смеси для лигирования, приведенной на этапе Д, и инкубируют при 12 °С 3 ч и далее при комнатной температуре еще 3 ч.
Реакционную смесь разливают по порциям в эппендорфов-ские пробирки и хранят при —20°С для последующей трансформации.
3. Транформация бактерий плазмидой,
полученной на этапе III, Ж
Описанный метод, разработанный Ханаханом (Hanahan,
1983), представляет собой высокоэффективный способ трансформации Е. coli плазмидной ДНК.
Выращивают Е. coli DH-1 до А550 = 0,5 в 100 мл среды SOB и собирают бактерии центрифугированием при 4000 об/мин в течение 10 мин при 2°С. Осадок бактерий суспендируют в среде TFB1); объем этой среды составляет 7з исходного объема культуры. Суспензию инкубируют во льду 10 мин и осаждают клетки центрифугированием в описанных выше условиях. Клетки ресуспендируют в среде TFB, объем которой соответствует 8% исходного объема культуры, и оставляют во льду. Добавляют свежий ДМСО до конечной концентрации 3,5% (7 мкл на 200 мкл суспензии клеток), осторожно перемешивают и инкубируют во льду еще 5 мин. Добавляют ДТТ (2,25 М раствор в 40 мМ ацетате калия, pH 6,0) до конечной концентрации 75 мМ (7 мкл раствора на 200 мкл суспензии) и оставляют во льду еще на 10 мин.
•> Среда TFB: 10 мМ калий-МЕБ-буфер, pH 6,20; 100 мМ RbCl; 45 мМ MgCJ2-4H20; 10 мМ СаС12-2Н20; 3 мМ НАСаС13 (Hanahan, 1983).
Клонирование кДНК
69
К суспензии бактериальных клеток добавляют ДМСО (такой же объем, как и первый раз) и инкубируют во льду 5 мин. Аликвоты клеточной суспензии разливают в охлажденные полипропиленовые пробирки 17X100 мм (по 210 мкл на пробирку), добавляют в каждую пробирку по 5 мкл лигированной плазмиды и инкубируют во льду 30 мин. Резко повышают температуру до 42 °С (тепловой шок) в течение 90—120 с, помещают клетки обратно в лед, добавляют 850 мкл среды SOB (комнатной температуры) и инкубируют при 37 °С при 225 об/мин в течение 1 ч. Аликвоту объемом 100 мкл вносят в чашку с LM-агаром, содержащим ампициллин, аккуратно растирают стеклянным шпателем и инкубируют при 37 °С в течение ночи.
Рекомендуется точно соблюдать условия, описанные в статье Ханахана (Hanahan, 1983).
И. Селекция с помощью гибридизации
При наличии соответствующего зонда для гибридизации метод гибридизации колоний на фильтрах представляет собой один из наиболее мощных и эффективных способов скрининга трансформантов в отношении нужного клона кДНК или по крайней мере уменьшения сложности в полученной библиотеке кДНК. Варианты метода были описаны в литературе (например, Maniatis et al., 1983).
К. Индукция триптофанового оперона
и получение бактериального экстракта
Поскольку плазмида содержит триптофановый промотор, репрессированный в нормальных условиях, необходимо индуцировать клетки, чтобы получить экспрессию тех кДЦК» которые могут содержаться в плазмидах. Обычно в качестве мощного индуктора триптофанового оперона применяют индолилакрило-вую кислоту (ИАК) (Morse et al., 1969). Индуцируемые клетки выращивают на среде М9, содержащей 0,25% казаминокис-лот и 0,5% глюкозы. После выращивания в течение ночи при температуре 30 °С культуру разбавляют в 10 раз свежей средой М9 (плюс казаминокислоты и глюкоза) и инкубируют при 30 °С 1 ч. Добавляют 1/100 объема раствора ИАК (1,5 мг/мл в этаноле) и инкубируют культуру еще 2 ч при 30 °С (Halle-well, Emetage, 1980).
Для мечения синтезированных полипептидов с помощью радиоактивного изотопа клеточную суспензию (1 мл) инкубируют с радиоактивными аминокислотами (например, 355-цистеином, 10 мкКи/мл) при 30 °С в течение 20 мин после двухчасовой преинкубации с ИАК-
70 Глава 3
JI. Скрининг с помощью антител
