Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
10. Раствор центрифугируют в центрифуге Sorval при 15 000 об/мин, супернатант сливают и ставят пробирку на 5 мин вверх дном на фильтровальную бумагу. На этой стадии можно растворить ДНК в 1,0 мл Н20 и гидролизовать соответствующими рестриктазами для последующего анализа с помощью гель-электрофореза, однако препараты еще содержат большое количество загрязняющей РНК (рис. 4-2, А).
11. Дальнейшей очистки плазмидной ДНК достигают благодаря осаждению РНК с помощью СаС12 (Mukhopadhyay, Man del, 1983):
а. Осадок, полученный на этапе 10, растворяют в 950 мкл ТЭН-буфера, переносят в эппендорфовскую пробирку и добавляют 50 мкл 1,0 М СаС12. Инкубируют 60 мин во льду, чтобы дать возможность избирательно выпасть осадку РНК.
б. Центрифугируют на микрофуге, супернатант переносят в две эппендорфовские пробирки на 1,5 мл (~400 мкл в каждую).
в. В каждую пробирку добавляют по 40 мкл ацетата натрия, pH 7,5, заполняют ее доверху этанолом и инкубируют 5 мин при —70 °С в смеси спирт — сухой лед. Выпавший осадок ДНК центрифугируют на микрофуге и ресуспендируют ДНК в 1,0 мл Н20 (рис. 4-2,Б,В).
С помощью этого метода можно получить до 1 мг высоко-очищенных плазмид. Малые РНК (такие как тРН;К), которые являются единственными примесями в таких препаратах, устраняются на дальнейших этапах очистки (этап 12). Однако все ферментативные реакции с этими препаратами (гидролиз рестриктазами, ник-трансляция, реакция с ферментом Кленова, лигирование и т. д.) протекают столь же эффективно, как и в случае плазмид, очищенных с помощью градиента хлористого цезия. Далее фрагменты рестрикции ДНК можно очищать в низкоплавкой агарозе или полиакриламидных гелях без каких-либо сложностей.
{-
Рнс. 4-2. Гель-электрофорез плазмид методом, описанным в разд. IV,Б, На каждую дорожку наносили 1 мкл из конечного объема 1 мл. А. Неочищенный материал после осаждения изопропанолом. Б. Ресуспендироваиная РНК из осадка в виде кальциевой соли. В. Раствор плазмиды после осаждения РНК хлористым кальцием. Г—3. Плазмида, которая была в дальнейшем очищена с помощью микроварианта гель-хромотографии. Гидролизы: от А до Г — ?coRI; Д — EcoRI и ВатШ\ Е — 5отН1; Ж — ЕсоШ и PstI; 3 — PstI.
80 Глава 4
Рис. 4-3. Подготовка мини-колонки для микроварианта гель-хроматографии. В голубом наконечнике для эппендорфовской пипетки на 1,0 мл (А1) отверстие закрывают стеклянной ватой (А2). Нагретым металлическим пробойником в крышке (АЗ) пробирки для замораживания (объем 2,0 мл, диаметр 12 мм) (А4) делают отверстие. В стенке этой пробирки делают маленькое отверстие иглой (показано стрелкой). Колонку собирают (Б), заполняют ее сефарозой CL-4B до верхней части наконечника (В) и центрифугируют в мини-фуге 2 мин при 1000 об/мин. Г. Колонка готова для загрузки раствором плазмидной ДНК.
12. Дальнейшую очистку плазмид проводят путем удаления малых РНК с помощью микроварианта гель-хроматографии (Krieger, Tobler, 1977; Neal, Florini, 1973).
а. Готовят гель, как показано на рис. 4-3.
б. Центрифугируют на мини-фуге 2 мин при 1000 об/мин.
в. Удаляют со дна пробирки и наносят на гель сефарозы, находящийся в наконечнике эппендорфовской пробирки, 100—500 мкл препарата плазмидной ДНК (из 1,0 мл раствора, полученного в разд. IV, Б, II, в). Центрифугируют
3 мин и собирают раствор, содержащий очищенные плазмиды, со дна большой пробирки (рис. 4-2, Д-3).
В. Очистка фрагментов ДНК
в геле легкоплавкой агарозы
Приготовление геля:
а. Используют аппарат для горизонтального электрофореза (например, BRL, модель НЗ) с препаративной гребенкой
Конструирование векторов
81
и пластинкой из плексигласа (размеры ~ 10X10X1 см), помещенной на дно аппарата. Между гребенкой и краем аппарата остается свободное пространство примерно в 1 см. Пластинка и гребенка должны быть параллельны друг другу. В зависимости от размера фрагмента, который собираются выделить, пространство, окружающее плексигласовую пластинку, заполняют агарозой с концентрацией от 0,8 до 1,6%.
б. После того как агароза застыла, плексигласовую пластинку удаляют и заполняют занимаемое ею пространство низкоплавкой агарозой (0,6%-ной в ТА-буфере); внимание: низкоплавкая агароза требует для застывания большего времени.
в. Гидролизованный образец наносят в гель (до 200 мкг ДНК) и для хорошего разрешения проводят медленное электрофоретическое разделение (в течение ночи при 20—30 В).
г. Нужную полосу вырезают скальпелем под УФ-лампой.
д. Переносят ее в полипропиленовую пробирку на 15 мл и инкубируют 15 мин при 65 °С, для того чтобы расплавить агарозу.
е. Определяют объем и добавляют 1/10 объема 0,5 М NaCl, так чтобы конечная концентрация NaCl составляла 500 мМ.
ж. Добавляют равный объем насыщенного фенолом 500 мМ NaCl и интенсивно перемешивают.
з. Смесь центрифугируют, собирают супернатанты и повторно экстрагируют фенолом, насыщенным 500 мМ NaCl, до исчезновения нерастворимого материала на границе раздела фаз (обычно требуется две или три экстракции).
