Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Лефковитса И. -> "Иммунологические методы исследований" -> 23

Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.

Лефковитса И., Перниса Б. Иммунологические методы исследований — М.: Мир, 1988. — 530 c.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка): immunologicheskiemetodi1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 17 18 19 20 21 22 < 23 > 24 25 26 27 28 29 .. 239 >> Следующая

2 объема абсолютного этанола и оставляют на ночь при —20 °С.
в. Присоединение oligo(dT)-концевых последовательностей к продуктам pcDV 1 -Kpnl-гидролиза
Осажденный спиртом гидролизат pcDVl-JCpnl центрифугируют 10 мин в эппендорфовской центрифуге и супернатант отбрасывают. Осадок промывают 70%-ным этанолом, высушивают н растворяют в 50 мкл Н20.
Реакционная смесь
ДНК в Н20 50 мкл
5Х Буфер для ТдН-трансферазы, 24 мкл 10 мМ СоС12 12 мкл 10 мМ dTTP 1,2 мкл
32P-dTTP 10 Ки/мл, 0,07 мкл (7/200Xразведение, 2 мкл) Н20 28,7 мкл
ТдН-трансфераза 15 ед./мкл, 4 мкл (60 ед.)
Общий объем 120 мкл
60 Глава 3
Температуру реакционной смеси доводят до 37°С и затем добавляют ТдН-трансферазу, после чего начинается реакция. Отбирают 2 пробы по 2 мкл в нулевой момент времени и 4 пробы по 2 мкл через 10 мин после начала инкубации и наносят их на фильтры во флаконах для сцинтилляционного счета.
По окончании 10-минутной инкубации реакционную смесь переносят в воду со льдом, для того чтобы остановить реакцию. Два фильтра А, относящихся к нулевому моменту, и два фильтра Б, относящихся к 10-минутной инкубации, промывают во флаконах пятью порциями раствора 0,5 М Na2HP04 по 5 мин каждой порцией. После этого по одной минуте промывают 2 раза водой и 2 раза этанолом. Фильтры высушивают и определяют радиоактивность в толуольном сцинтилляторе. Два других фильтра В, соответствующих 10-минутной инкубации, не отмывают. При их измерении определяют общую радиоактивность, присутствущую в реакционной смеси.
Длина oligo(dT)-последовательности, приходящаяся на один конец, составляет [12 нмоль X (Б—А)/В]/число концов ДНК (нмоль). Если ее длина достаточна (50—60 dT-нуклеотидов/ко-нец), то ферментативную реакцию на этом прекращают. Если же ее длина недостаточна, то проводят повторную инкубацию при 37 °С в течение времени, необходимого для получения нужной длины. Реакцию останавливают во льду и повторяют описанные выше процедуры.
г. Гидролиз под действием
Eco RI рестрикта pcDVl—Kpnl с присоединенными концевыми последовательностями
ДНК в буфере для ТдН-трансферазы 108 мкл 10Х Буфер для рестрикции ?coRI 50 мкл Н20 342 мкл Общий объем 500 мкл Смесь прогревают при 65 °С 20 мин, охлаждают до 37 °С, добавляют 100 ед. ?coRI и инкубируют при 37 °С 3 ч. Отбирают пробу объемом 2 мкл и проводят электрофорез в 1,5%-ном агарозном геле для проверки полноты гидролиза.
Если гидролиз прошел полностью, то гидролизаты разделяют в 1,5%-ном препаративном агарозном геле и выделяют самый длинный фрагмент (который представляет собой вектор-затравку), вырезая полоску геля, содержащую нужную ДНК, и элюируя ДНК с помощью электрофореза в 0,5Х ТБЭ-буфере.
Клонирование кДНК
61
д. Очистка вектора-затравки с oligo(dT)-концевой
последовательностью на колонке с oligo(dA)-целлюлозой
Концентрацию NaCl в растворе ДНК, полученном с помощью электроэлюции, доводят до 1,0 М, концентрацию трис-НС1, pH 8,— до 10 мМ и концентрацию ЭДТА — до 1 мМ. Раствор охлаждают до 4 °С и пропускают через колонку с oligo(dA)-целлюлозой, уравновешенной 1,0 М NaCl в 1ХТЭ-буфере при 4 °С.
После нанесения раствора колонку интенсивно промывают этим же буфером при 4°С. Уравновешивают колонку при комнатной температуре и элюируют ДНК с помощью Н20 при комнатной температуре. Собирают фракции по 10 капель и определяют их радиоактивность с помощью счета по Черенкову. Фракции, соответствующие пику радиоактивности, объединяют, осаждают элюированную ДНК двумя объемами этанола при —20 °С в течение ночи и растворяют осадок в 25 мкл 1X ТЭ-буфера. Отбирают пробу объемом 2 мкл, разводят ее в 200 раз и определяют А2бо и А28о, чтобы оценить количество ДНК и проверить ее чистоту1). После подведения концентрации ДНК к 1—1,5 мкг/мкл пробу хранят в 15%-ном этаноле, 1ХТЭ-бу-фере при —20 °С.
Г. Получение линкеров
Основной подход при получении линкеров такой же, как и при получении вектора-затравки.
1. Гидролиз плазмиды ptrpLM рестриктазой Pvul ДНК 500 мкг
10 X Буфер для рестрикции Pvul (РшЬбуфер) 1 мл Н20 до конечного объема 10 мл Рестриктаза Pvul 4 ед./мкл, 75 мкл (300 ед.)
Смесь инкубируют при 37 °С 3 ч. После инкубации отбирают 2 мкл и проверяют полноту гидролиза с помощью электрофореза в 1,5%-ном агарозном геле.
Если гидролиз прошел полностью, то раствор дважды экстрагируют смесью фенол—севаг и 1 раз эфиром, после чего добавляют 1/30 объема 3 М ацетата натрия и 2 объема этанола.
¦> Раствор ДНК с концентрацией 1 мг/мл должен иметь A26Q=20: чистая ДНК должна иметь соотношение А260/А260=1,8.
62 Глава 3
2. Реакция присоединения
оИцо{(Ю)-концевой последовательости в присутствии ТдН-трансферазы
ДНК, высушенный осадок после осаждения этанолом 5х Буфер для ТдН-трансферазы 40 мкл 10 мМ dGTP 4 мкл
32P-dGTP 10 мкКи/мкл, 3000 Ки/ммоль, 1,5 мкл Н20 134,5 мкл
ТдН-трансфераза (Pubst Labs) 15 ед./мкл, 240 ед. (16 мкл)
Реакционную смесь подогревают до 37 °С 5 мин и затем добавляют ТдН-трансферазу, после чего начинается реакция. Последующие этапы те же, что и в разд. III, В, 2, в.
Предыдущая << 1 .. 17 18 19 20 21 22 < 23 > 24 25 26 27 28 29 .. 239 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed