Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
54 Глава 3
Берга приведена на рис. 3-2, а на рис. 3-3 представлена плазмида pcDVl [детали, касающиеся экспрессии кДНК, рассмотрены в отдельной работе (Harris, 1983)].
III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ПРОЦЕДУРЫ
А. Материалы общего назначения и исходные растворы
Все растворы (за исключением трис-буферов и ДСН), а также стеклянную посуду обрабатывают 0,1%-ным раствором ди-этилпирокарбоната (ДЭПК) или прогревают при температуре 250°С в течение ночи.
По возможности следует отказаться от использования стеклянной посуды и работать со стерильной пластиковой посудой одноразового пользования.
1. 2 М трис-НС1, pH 7,5
2. 2 М трис-НС1, pH 8,0
3. 5 М NaCl
4. 2 М КС1
5. 1 М MgCl2
6. 0,2 М ЭДТА, pH 8,0
7. 20%-ный ДСН
Все эти исходные растворы должны быть проавтоклавиро-ваны.
Б. Получение полисомной мРНК
1. Материалы.
а. ТКМ-буфер для промывки:
Трис-НС1, pH 7,5, 50 мМ КС1 25 мМ
MgCh 5 мМ
Сахароза 0,25 мМ (свободная от РНКазы)
Циклогексимид 10 мкг/мл (готовят раствор с концентрацией 10 мг/мл и фильтруют его)
ВРК (ванадийрибонуклеозидный комплекс, ингибитор РНКазы) 10 мМ (используют свежеприготовленный препарат) (или РНКазин, 1000 ед./мл)
2-Меркаптоэтанол 5 мМ
б. ТКМ-буфер для лизиса: ТКМ-буфер для промывки, содержащий 0,5—1% NP-40
в. 0,5 М и 2,0 М сахароза, приготовленная на ТКМ-буфере для промывки
Клонирование кДНК
55
г. ЮхТЭ-буфер: трис-НС1 0,1 М, pH 8,0
ЭДТА-Ыа2 0,01 М
д. Перегнанный фенол
е. Хлороформ/изоамиловый спирт (24:1=севаг)
ж. 3,0 М ацетат натрия
з. Этанол, абсолютный и 70%-ный
и. 0,5 М NaCl в 1хТЭ-буфере, содержащем 0,2% ДСЛ (додецилсульфата лития)
к. Колонка с oligo(dT)-целлюлозой
Oligo(dT)-целлюлоза: тип 7 (P. L. Biochemicals) Колонка Econocolumn (Bio-Rad) размером 0,7X15 см л. ДМСО (чистый для УФ-спектроскопии) м. Буфер, содержащий 1 М LiCl, 0,05 М ЭДТА, 2% ДСН (вес/объем), 0,01 М трис-НС1, pH 6,5
и. Вода, обработанная 0,1%-ным ДЭПК (трижды перегнанная в стеклянной посуде) о. Пластмассовые пробирки (Falcon): стерильные одноразового пользования на 50 и 15 мл п. Пластиковые пипетки: стерильные одноразового пользования
р. Полиэтиленовые стерильные пипетки для переноса одноразового пользования (Falcon № 7575) с. Центрифужные пробирки из поликарбоната для ротора 60Ti (обработанные ДЭПК)
2. Получение полисом из клеток, выращенных в культуре
а. К среде, в которой растут клетки, добавляют циклогекси-мид до конечной концентрации 10 мкг/мл и инкубируют при температуре выращивания в течение 10 мин.
б. Клеточную суспензию охлаждают, помещая культуральные флаконы в ледяную воду.
в. Клетки (1—2-109 клеток) собирают путем центрифугирования, используя для последнего центрифугирования пластиковую пробирку на 50 мл.
г. Осадок клеток ресуспендируют в 20—40 мл охлажденного ТКМ-буфера для промывки и центрифугируют еще раз, чтобы осадить клетки.
д. Осадок клеток ресуспендируют в 20 мл охлажденного ТКМ-буфера для лизиса. С помощью стерильной полиэтиленовой пипетки для переноса суспензию несколько раз набирают в пипетку и выпускают. Полноту лизиса клеток проверяют под микроскопом.
е. Лизат переносят в чистую обработанную ДЭПК центрифужную пробирку Sorvall иа 50 мл и центрифугируют при
56 Глава 3
900 об/мин в течение 10 мин на роторе SS-34.
ж. Супернатант сливают в пластмассовую пробирку.
з. Готовят ступенчатые сахарозные градиенты (0,5 М/2,0 М) (по 5 мл каждого раствора) в двух поликарбонатных пробирках от ротора 60Ti и наслаивают супернатант, полученный на предыдущем этапе (ж).
и. Центрифугируют при 35 000 об/мин в течение 3,5 ч при 4°С в роторе 60Ti.
к. Супернатант сливают и удаляют следы жидкости из пробирки. На дне пробирок остаются прозрачные осадки полисом.
л. В каждую пробирку вносят по 2 мл ТКМ-буфера для лизиса и оставляют во льду на 1 ч, для того чтобы осадки набухли.
м. Осадки суспендируют в буфере и переносят полученную суспензию в пластмассовую пробирку. Центрифужную пробирку'споласкивают ТКМ-буфером для лизиса (общий объем 4 мл) и объединяют этот раствор с раствором, в котором исходно был суспендирован полисомный осадок.
3. Очистка полисомной РНК
а. К суспензии полисом добавляют ДСН до конечной концентрации 0,2%, подогревают смесь до 37 °С и инкубируют при этой температуре в течение 10 мин.
б. Полисомную суспензию экстрагируют фенолом. После первой и второй экстракции к фенольной фазе и интерфазе добавляют 2 мл 1ХТЭ-буфера и 2 мл свежего фенола. Экстракцию проводят до тех пор, пока не исчезнет интерфаза.
в. К водной фазе добавляют 1/30 объема 3 М ацетата натрия и 2,5 объема абсолютного этанола и оставляют при —20 °С на ночь.
г. Смесь центрифугируют при 3500—4000 об/мин в течение 15 мин при 4°С. Если осадка очень мало, центрифугируют еще раз при скорости 15 000 об/мин в течение 20 мин, используя ротор SE-27.
д. Супернатант сливают и осадки высушивают.
4. Очистка poly(A)-PHK
а. Осадкн растворяют в 20 мл IX ТЭ-буфера.
