Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
Примечание. Рекомендуется провести предварительные аналитические опыты, используя, например, гидролизат pBR322 — Pvul. После получения необходимой длины oligo(dG)-концевой последовательности (10 dG-остатков) используют реакционную смесь, описанную выше.
Примечание. Одна молекула ДНК плазмиды ptrpLM дает четыре конца, к которым присоединяют концевые последовательности oligo(dN) после гидролиза Pvul.
Реакционная смесь для ТдН-трансферазы (200 мкл, ~500 мкг ДНК)
10Х Буфер для рестриктазы tfmdlll 100 мкл Н20 700 мкл
tfindlll 17 ед./мкл, 30 мкл Смесь инкубируют при 37 °С 3 ч и проверяют полноту гидролиза, как на этапе III, Г, 1.
Если гидролиз прошел полностью, то гидролизат разделяют с помощью препаративного электрофореза в 2%-ной легкоплавкой агарозе и выделяют необходимый фрагмент ДНК путем электроэлюции. Элюированную ДНК наносят на Elutip (Schleicher — Schiill), элюируют и осаждают этанолом (см. бюллетень 206 фирмы Schleicher — Schiill).
Осадок ДНК растворяют и проверяют препарат, как указано в разд. III, В, 2, д. Концентрацию ДНК доводят до 1 мкг/мкл в IX ТЭ-буфере и 15%-ном этаноле и хранят при —20°С.
Д. Синтез кДНК
1. Материалы
мРНК — 1 мкг/мкл Метил ртуть (МР) 0,1 М 2-Меркаптоэтанол (2-МЕ) 0,7 М
Клонирование кДНК
63
РНКазин 35 ед./мкл
Вектор-затравка (см. разд. III, В) ~1 мкг/мкл (~0,5 пмоль/мкл)
ЮхБуфер для обратной транскриптазы:
0,5 М трис-HCl рН8,3
0,08 М MgCl2
0,3 М КС1 3 мМ ДТТ
Смесь dCTP, dGTP и dTTP, концентрация каждого нуклеотида 12,4 мМ; dATP 4,2 мМ 32P-dATP 3000 Ки/ммоль, 10 мкКи/мкл 10Х Стоп-буфер: 0,2 М ЭДТА, 5% ДСН Фенол—севаг, смесь равных объемов фенола и севага Ацетат аммония 5 М Этанол абсолютный и 70%-ный ТЭ-буфер ЮХ и IX
Обратная трискриптаза 20 ед./мкл (Cambridge Biotechnology, номер по каталогу PHS1838)
2. Синтез кДНК
а. Денатурация мРНК
Смешивают следующие ингредиенты: мРНК —3 мкг (—3 мкл)
0,02 М метилртуть 2,5 мкл Н20 до 5,5 мкл
Смесь инкубируют при комнатной температуре 10 мин, добавляют 3 мкл смеси 0,7 М 2-МЭ и РНКазина (2 мкл+6 мкл) и вновь инкубируют при комнатной температуре 5 мин.
б. Реакция в присутствии обратной транскриптазы
К материалу, полученному на этапе III, Д, 2, а, добавляют следующие ингредиенты:
Вектор-затравка ~ 1 мкг/мкл, 3 мкл (—],5 пмоль)
10Х Буфер для обратной транскриптазы 15 мкл
Смесь трех dNTP 18 мкл
32P-dATP 10 мкКи/мкл, 10 мкл
Актиномицин D 1 мг/мл, 15 мкл
Н20 66 мкл
Обратная транскриптаза (20 ед./мкл) 10 мкл Смесь инкубируют при 37 °С 20—30 мин.
Примечание. Наилучшее соотношение между вектором-затравкой и мРНК, которое обеспечивает наиболее эффективный отжиг, определяют в предварительных экспериментах.
64 Глава 3
Примечание. Чтобы получить максимальное включение dNTP, время инкубации также определяют в предварительных экспериментах. Отбирают 2 аликвоты по 2 мкл в нулевой точке инкубации и 4 аликвоты по 2 мкл после завершения инкубации и наносят их на диски ДЭАЭ-бумаги DE82 (диамер 2,5 см), находящиеся в пластмассовых флаконах для сцинтилляционного счетчика. Два фильтра, соответствующие нулевой точке инкубации, и два фильтра после инкубации промывают, как указано для этапа III, В, 2, в.
Количество синтезированной кДНК рассчитывают следующим образом:
1. Общее количество включившейся радиоактивности (имп/мин) = Радиоактивность (имп/мин) в конце инкубации— Радиоактивность (имп/мин) в нулевой точке инкубации = А.
2. Общее количество радиоактивности в реакционной смеси (имп/мин) = Радиоактивность (имп/мин) непромытого фильтра = Б.
3. кДНК (нг) = 325 (нг)-0,5 (нмоль/мкл) '4-Объем реакционной смеси (мл) - А/Б.
После инкубации отбирают по две аликвоты объемом 5 мкл для анализа с помощью электрофореза. Одну из аликвот подвергают электрофорезу в 1,5%-ном агарозном геле, приготовленном на IX ТБЭ- или IX ТА-буфере. В качестве маркеров молекулярной массы используют, например, гидролизат ДНК фага X, полученный с помощью рестриктазы Hindlll и меченный по концам 32Р. По завершении электрофореза гель высушивают и получают радиоавтограф. Другую аликвоту анализируют в щелочном агарозном геле (1—1,5%) в соответствии с условиями, описанными Мак-Донеллом и др. (McDonnell et al., 1977). После электрофореза гель высушивают и получают радиоавтограф.
Примечание. Если размеры комплекса кДНК — вектор-затравка при разделении в щелочном геле (распределение по размерам)1 значительно меньше, чем при разделении в нейтральном, это свидетельствует о том, что реакция прошла не полностью и продукт кДНК не является полноразмерным.
К остальной части реакционной смеси добавляют 30 мкл 10Х стоп-буфера и проводят несколько экстракций смесью фенол— севаг до тех пор, пока с границы раздела фаз не исчезнет нерастворимый материал. Радиоактивность пробы проверяют с помощью лабораторного монитора, чтобы избежать потерь. Первую водную фазу экстрагируют эфиром или хлороформом, добавляют 2/3 объема 5 М ацетата аммония, 2 объема этанола и оставляют на ночь при —20 °С.
