Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
Если имеются антитела или антисыворотки, специфические в отношении продуктов, кодируемых кДНК, колонии трансформантов на нитроцеллюлозных фильтрах или фильтрах Whatman 541 (Taub, Thompson, 1982) можно подвергнуть скринингу in situ вслед за индукцией ИАК. Фильтр с колониями переносят в чашки со средой М9, содержащей казаминокислоты, глюкозу и ИАК, без амплификации в присутствии хлорамфеникола и инкубируют при 30 °С 3 ч (фильтр кладут на поверхность агара стороной, содержащей колонии). Далее фильтры обрабатывают описанным ниже образом и инкубируют с антителами (J. Andersson, личное сообщение).
1. Фильтры замачивают в 0,5 М NaOH в течение 5 мин, меняя раствор один раз.
2. Фильтры нейтрализуют в 0,5 М трис-НС1, pH 8, в течение 5 мин, меняя раствор один раз.
3. Фильтр отжимают на бумаге Whatman 3 ММ.
4. Фильтры помещают в ЗФР (NaCl, забуференный фосфатом), содержащий 10X раствор Денхардта, и инкубируют 1 ч при комнатной температуре, периодически встряхивая.
5. Фильтры переносят в ЗФР, содержащий разбавленные антитела и 5%-ный БСА, при комнатной температуре и инкубируют 1 ч, периодически встряхивая.
6. Фильтры промывают ЗФР при комнатной температуре; продолжительность каждой промывки со встряхиванием 2— 5 мин, число промывок 5—8.
7. Готовят смесь белка А, меченного 12Б1 (на 10 фильтров требуется 15 мл смеси): 5% БСА, 106 имп/(мин-мкл) в ЗФР.
8. Фильтры погружают в раствор, содержащий белок А, и инкубируют 1 ч при комнатной температуре со встряхиванием.
9. Фильтры промывают несколько раз в ЗФР (примерно 5 раз) со встряхиванием.
10. Фильтры промывают в 95%-ном этаноле и высушивают на воздухе на бумаге Whatman 3 ММ.
11. Получают радиоавтографы фильтров.
IV. ОБЩИЕ ЗАМЕЧАНИЯ
А. Метод Хейдекера — Мессинга
Хейдекер и Мессинг (Heidecker, Messing, 1983) разработали другой метод клонирования кДНК (рис. 3-4), напоминающий метод Окаямы — Берга. Первый метод проще, чем второй, однако ориентация кДНК в плазмидном векторе при этом не фиксирована.
Клонирование кДНК
71
[ ^ Терминальная
EBS трансфераза ц = - ТТР т ттт=
EBS,
Терминальная ^ трансфераза dCTP
¦VWW.AAAA -
т т т т -/
| Poly (А)-РНК EBS
ТТТ Т
АААА^ллал
I Обратная транскриптаза * dNTP
ТТТТ «
" АлИ'^ЛЛЛ.
н I Терминальная трансфераза
1 1
“AAAA^-*^4V
\ 1 ? У Щелочной сахарозный градиент
/
н
CL н EBS
н EBS
н EBS
Буфер для ренатурации
О* О
Большой фрагмен- pci I Т рансформация 2- ТО4 кДНК-клоноБ.-мкг oUC9 (Т1
Рис. 3-4. Схема метода Хейдекера — Мессинга Е, В, S и Н — сайты рестрикции эндонуклеаз fcoRI, BamHI, SalI и Hind\\\ соответственно в сайте pUC9 для множественного клонирования.
В связи с этим обстоятельством вероятность экспрессии кДНК составляет лишь половину по сравнению с вероятностью при использовании метода Окаямы — Берга. Более того, вектор должен иметь соответствующий рестрикционный сайт, чтобы вставить кДНК в нужном положении по отношению к промотору.
Тем не менее благодаря своей простоте этот метод очень удобен, особенно при конструировании клонов кДНК с целью получения «состыкованных» полипептидов.
72 Глава 3
Б. Состыкованные полипептиды
Как правило, продукты, кодируемые чужеродной ДНК, являются нестабильными в клетках Е. coli; после синтеза они подвергаются быстрой деградации. Вместе с тем состыкованные полипептиды, которые частично кодируются кДНК эукариотической клетки, а частично геном Е. coli, как правило, стабильны.
Хотя состыкованные полипептиды не обладают биологической активностью, их можно выявить с помощью антител (при их наличии), в том случае, конечно, если состыкованные полипептиды несут соответствующие антигенные детерминанты.
Например, кДНК, синтези-Рис. 3-5. Структуры плазмид pUR рованная с помощью одного
278, 288, 289, 290, 291, 292. Н, X, S, из стандартных методов, МО-
ре,Тт бЫТЬ С/ЙТУ
ответственно. плазмиды ptrpLl (Edman
et al., 1981). В этом случае
происходит образование химерного продукта гена (З-лак-
тамазы и кДНК; синтез осуществляется за счет р-лактамазных промоторов и триптофанового промотора, который находится «вверх по течению» в данном гене; соответствующая мРНК кодирует состыкованный полипептид.
При использовании этого подхода кДНК не должна нести стоп-кодона; в противном случае синтез пептида обрывается в положении, соответствующем стоп-кодону, и пептид, кодируемый геном Е. coli, не синтезируется. С этой точки зрения наиболее предпочтительны плазмиды серии pUR (рис. 3-5), полученные Рюттером и Мюллер-Хиллом (Rutter, Miiller-Hill, 1983), поскольку сайт, по которому производится вставка кДНК, находится в области конца /ccZ-гена.
