Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
Cl C2C3C4 C5C6
>---------m-*-----------—— m—i
EcoRI EcoRI EcoRI
I--------- ----------Л -----------------J
BamHI
BamHI BamHI
Рис. 4-4. Полный V+CnH.CaTNP-ген, клонированный в Х-бактериофаге Ха-рон 4А, был перенесен в feoRI-сайт вектора для эукариотической селекции pSV2neo (Л). V+CxaTNP-ген, клонированный в бактериофаге к Харон 28, был вставлен в уникальный BamHI-сайт вектора для эукариотической селекции pAG60 (В) или в конструкцию А для получения полного гена aTNP иммуноглобулина (содержащего тяжелую и легкую цепи) в векторе для эукариотической экспрессии (В).
общего материала, была видна. Для локализации нужной полосы применяют маркеры соответствующего размера.
в. Линеаризованную плазмиду экстрагируют из геля, как описано в разд. IV, В, г—л.
г. Лигирование (разд. IV, Г) проводят в течение короткого отрезка времени, чтобы избежать лигирования разорванных молекул по тупым концам (15 мин при комнатной температуре), трансформируют компетентные бактерии (разд. IV, Д) и высевают их в соответствующие чашки.
д. Нужные колонии отбирают на основе анализа плазмид-
Конструирование векторов
85
llwn
Рис. 4-5. Фрагменты V+Сц илн V+CxSP6aTNP-reHa, вставленные в различные векторы (соответственно А, Б и Ж). Такие редуцированные гены содержат несколько уникальных рестрикционных сайтов, что облегчает последующую обработку ферментами, например, гидролиз 1) вектора А рестриктазой Hindlll с последующей обработкой нуклеазой Ва/31 (Г, Д) для удаления сайта сплайсинга Уз или 2) короткой последовательности ДНК рестриктазами Ват HI и SacI с последующей обработкой нуклеазой S1 и лигированием по тупым концам для удаления Б'-проксимального С2ц-сайта сплайсинга в конструкции Е. Для изучения механизма контроля экспрессии гена иммуноглобулина (3) проводили химеризацию путем вставки гена тяжелой цепи SP6 V в инт-рон гена SP6U+CX после удаления одного /ftndIII-сайта за счет делеции фрагмента ?coRI—BamHl конструкции В. (Iglesias, Kohler, 1985).
ной ДНК, полученной с помощью мини-метода (разд. IV, А) и рестрикционного анализа.
4. Селекция методом гибридизации колоний с зондом, меченным 32Р, описаца в литературе (Grunstein, Hognes, 1975).
86 Глава 4
5. Селекцию мутировавших последовательностей ДНК, полученных в результате сайт-специфического мутагенеза на основе использования синтетических полинуклеотидов, описали Норрис и др. (Norris et al., 1983).
Примечание. Важно подтвердить наличие ожидаемой мутации ДНК in vitro путем секвенирования соответствующей ДНК.
V. ПРИМЕРЫ КОНСТРУКЦИЙ
А. Конструкции, полученные на основе генов [gM (генов анти-TNP легкой и тяжелой цепей)
1. Конструкции в векторе pSV2neo, содержащие гец анти-TNP тяжелой цепи индивидуально (рис. 4-4,А), ген анти-TNP х-легкой цепи индивидуально (рис. 4-4, В) и полные гены функциональных цепей иммуноглобулинов (гены анти-TNP легкой и анти-TNP тяжелой цепей) (рис. 4-4,Б). Такие конструкции вводили в лимфоидные и нелимфоидные клетки для изучения тканеспецифической экспрессии (McCubrey, Kohler, 1985; Ochi et al., 1983).
2. Конструкции «редуцированных» генов иммуноглобулинов, полученные за счет удаления нефункциональных интронов и фланкирующих последовательностей; дальнейшая работа с этими клонами менее трудоемка, поскольку можно использовать меньшие количества рестриктаз (рис. 4-5, А, Б и Ж).
Б. Работа с клонированными генами in vitro
1. Делеция части гена или фланкирующих последовательностей, принимающих участие в контроле экспрессии, процессинге РНК и т. д.
а) За счет делеции с помощью соответствующих рестриктаз (рис. 4-5, Е).
б) За счет делеции с помощью нуклеазы Ва/31 (рис. 4-5, Г и Д).
2. Химеризация гена за счет вставки участков генов (экзо-нов) или элементов, контролирующих экспрессию, для изученич экспрессии генов (рис. 4-5, 3)
3. Изменение данной последовательности за счет сайт-специфического мутагенеза с помощью синтетических олигонуклеотидов [см. статью Кифера (Kiefer) J.
Литература
Batierji Olson L., Schaffner W. (1983). Cell, 33, 729.
Brinster R. L., Ritchie K. A., Hammer R. E., O’Brien R. L., Arp B., Storb U. (1983). Nature (London), 306, 332.
Конструирование векторов
87
Ganefin-Colbere F., Horodniecanu F., Kourilsky P., Garafin A. C. (1981). J. Mol. Biol., ISO, 1.
Gillies S. D., Morrison S. L., Oi V. Т., Tonegawa S. (1983). Cell, 33, 717. Grunstein М., Hognes D. (1975). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72, 3961.
Holmes D.. Quigley M. (1981). Anal. Biochem., 114, 193.
Iglesias A., Kohler G. (1985). In preparation.
Krieger М., Tobler J. (1977). Anal. Biochem., 81, 450.
McCubrey J., Kohler G. (1985). In preparation.
Mukhopadhyay М., Mandel N. C. (1983). Anal. Biochem., 133, 265.
Neal M. W., Florini J. R. (1973). Anal. Biochem., 55, 328.
