Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
цепь
Иммунопреци + + 1 + + + + + +
питация из
культуральных
жидкостей об
работанных ту-
ннкамицином
клеток
Иммунофлуо 15---25 15---25 1---2 1---2 5---10 НИ НИ НИ 1---4
ресценция на
спленоцитах, %
^ Не исследовано.
довольно трудно. В табл. 25-2 приведены перечень и характеристики моноклональных антител против иммуноглобулинов Xenopus.
VI. ИЗУЧЕНИЕ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ
А. Иммунопреципитация иммуноглобулинов и электрофорез
При изучении иммунных систем широко используется стандартный метод двойной иммунодиффузии, однако для получения тонких характеристик антител и антигенов может потребоваться анализ иммуноглобулинов в культуральных жидкостях или в сыворотках крови. В этих случаях сывороточные белки метят радиоактивным иодом, а иммуноглобулины, продуцируемые клетками в культуре, — биосинтетически или также иодом.
490 Глава 25
1. Иодирование сывороточных белков
10 мкл 1 М трис-буфера, pH 7,5, смешивают со 100 мкл сыворотки крови, после чего добавляют 0,25—0,5 мКи Na125I (Amersham) и 10 мкл хлорамина Т (5 мг/мл в воде). Смесь выдерживают в закрытой пробирке 2—10 мин при комнатной температуре, после чего для остановки реакции добавляют 20 мкл метабисульфита натрия (5 мг/мл в воде) и 0,1 М KI (добавление последнего не обязательно). Меченый материал наносят на колонку Dowex 41 100 (объем 2,5 мл), смывают
1 мл 1%-ного БСА в ЗФР с добавлением 0,1% NaN3 и хранят при —20 °С. Эффективность иодирования оценивают, измеряя радиоактивность супернатанта и осадка, образовавшихся после смешивания 10 мкл 10%-ной ТХУ и 10 мкл меченого материала. Обычно в осадке содержится 98% радиоактивности.
2. Биосинтетическое мечение
Клетки селезенки Xenopus промывают два раза в ЗФР для амфибий и ресуспендируют до концентрации 30-10® клеток/мл в среде RPMI 1640 без цистеина (набор № 300.7402, Gibco), которую делают Изотонической для клеток лягушки, добавляя в нее 30% дистиллированной воды, содержащей 10%-ную диализованную СПК- После 30 мин предварительной инкубации при 27 °С («голодание») в присутствии 5% С02 клетки осаждают и ресуспендируют в той же среде с 10%-ной диализованной СПК. Добавляют 355-цистеин или метионин (Amersham) до конечной концентрации 0,2 мКи/мл. Когда требуется получить дегликозилированные иммуноглобулины, в среду при предварительной и основной инкубации добавляют 1—10 мкг/мл (конечная концентрация) туникамицина или 2-дезоксиглюкозу (1—10 мМ) (Tkacz, Lampers, 1975). После инкубации в течение 15—16 ч при 27°С в атмосфере с 5% СОг клетки центрифугируют, промывают ЗФР и супернатант сохраняют. Клетки ресуспендируют в лизирующем буфере (2% NP40, 20 мМ трис-HCI, pH 8,0, 0,15 MiNaCI, 2 мМ MgCl2 и 0,1 мМ фенилме-тилсульфонилфторид) и выдерживают во льду 30 мин, встряхивая время от времени на вортексе. Лизат центрифугируют в микроцентрифуге и супернатант хранят при —80°С. Подробное описание этой методики приведено в работе Пинка и Зиглера (Pink, Ziegler, 1979).
3. Приготовление иммуносорбентов
В иммунологических исследованиях используются иммуносорбенты разных типов. Выделенные на колонке с белком А моноклональные антитела или белковые антигены, против которых необходимо получить очищенные антитела, могут быть
Изучение иммунной системы Xenopus
491
иммобилизованы на CNBr-активированной сефарозе 4В. Гелю дают набухнуть в 1 мМ НС1 в течение 15 мин и промывают его три раза тем же раствором. Затем его промывают буфером для связывания (0,1 М карбонат натрия/бикарбонат натрия, 1 М NaCl, pH 9,2), смешивают с белком (0,3—1 мг белка на 1 мл набухшего геля) и вносят в пробирки специального миксера, в котором они переворачиваются периодически вверх дном, на ночь при 4°С или на 2 ч при комнатной температуре. Гель три раза промывают буфером для связывания и инкубируют с 1 М этанол амином, pH 8, с переворачиванием пробирок в течение
2 ч при комнатной температуре для инактивации оставшихся свободных мест связывания на сефарозе. После этого гель со связанным белком попеременно промывают 0,1 М глицин — НС1-буфером, pH 2,2, содержащим 1 М NaCl, и буфером для связывания, pH 9,2 (до трех промывок каждым буфером). Сефарозу с иммобилизованным белком хранят в растворе (1:1 по объему), содержащем 0,5% NP40, 1 мМ трис, pH8,5,
0,5 М NaCl и 0,1% NaN3 (нонидет — натрий — трис—азид; ННТА) при 4°С.
4. Иммунопреципитация
Меченый материал смешивают с 10—20 мкл сефарозы в ННТА, связанной с анти-Ig или антигеном, и перемешивают содержимое переворачиванием пробирок 2 ч при комнатной температуре или в течение ночи при 4°С. Затем смесь центрифугируют, осадок ресуспендируют в буфере и перемешивают переворачиванием пробирок в течение 30 мин. Промывку повторяют один или два раза, а затем ресуспендируют гранулы сефарозы в буфере для образца (0,5 М трис, pH 6,8, 4% ДСН, 20% глицерола, бромфеноловый синий) с добавлением или без добавления 10%-ного 2-МЭ в зависимости от того, нужны или нет восстанавливающие условия. Перед нанесением на полиакриламидный гель образцы денатурируют в кипящей воде в течение 3 мин.
