Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
На поверхность затвердевшего геля наслаивают комплемент (морской свинки или Xenopus), предварительно адсорбированный клетка ми-мишеням и. Равномерного распределения комплемента (2 мл в разведении 1: 10) по поверхности геля достигают или покачиванием геля, или прокатыванием пипетки по гелю. Зоны лизиса эритроцитов появляются через 1—2 ч инкубации геля во влажной камере при 37 °С. Такие гели можно фотографировать в темном поле.
При ИЭФ образцы сыворотки крови лягушек можно наносить на гель на маленькие прямоугольники из фильтровальной бумаги. В зависимости от титров антител на один такой прямоугольник можно наносить от 5 до 100 мкл соответствующей сыворотки.
Описанный метод не очень чувствителен, но дает полезную информацию о гетерогенности антител. С его помощью выявляют в основном IgY-антитела. Использование дополнительных, вызывающих лизис антисывороток не обязательно, поскольку IgY Xenopus фиксируют комплемент морской свинки.
В. Оценка иммунного ответа на клеточном уровне
Обнаружение клеток, секретирующих иммуноглобулины,
методом локального гемолиза
(по Jerne et al., 1963; Cunningham Szenberg, 1968,
с некоторыми изменениями)
Клетки из культур или из селезенок иммунизированных лягушек осаждают в течение 30 с при 10 000 g в центрифуге фирмы Eppendorf. Супернатанты сохраняют для анализа на содержание антител. (За 24 ч до проведения анализа методом локального гемолиза культуральную среду в лунках панелей заменяют свежей, чтобы в день определения клетки находились в свежей среде, не содержащей антигена.) Клетки суспендируют в 80 мкл раствора ЗФР, изотонического в отношении клеток,
Изучение иммунной системы Xenopus
503
которые будут использованы в качестве мишеней. В случае эритроцитов барана осмолярность раствора соответствует таковой для млекопитающих, а комплемент морской свинки, адсорбированный конъюгированными с тринитрофенолом эритроцитами барана (Behrigswerke, Марбург, ФРГ), используют в разведении 1:24. Следует приблизительно подобрать число клеток для определения таким образом, чтобы на одну чашку приходилось не более 200 клеток, образующих зоны лизиса. При исследовании клеток, продуцирующих антитела к ДНФ, можно одновременно проводить тест на специфическое ингибирование лизиса, добавляя в одну из лунок двухлуночной панели ДНФ-лизин в конечной концентрации 10~4М. Эту панель накрывают покровным стеклом, герметизируют размягченной смесью парафин-бензин (2:1) и инкубируют при 37 °С 1 ч.
Лизис нагруженных белком А эритроцитов можно использовать при анализе у Xenopus клеток, образующих иммуноглобулины, по описанным в литературе методикам. Для такого анализа, так же как и для обратного локального гемолиза, необходимо определение оптимальных разведений (титрованием) кроличьих антител против иммуноглобулинов Xenopus. Например, нашу антисыворотку для использования в тесте с нагруженными белком А эритроцитами нужно разводить 1 :80, а для обратного гемолиза 1:256. Вероятно, антисыворотка обеспечивает более прочное связывание антител низкой аффинности с клетками-мишенями. Ни одни из известных моноклональных антител против IgY не дают присущего кроличьим антисывороткам усиливающего эффекта.
Использование комплемента морской свинки удобно, но это животное не лучший источник комплемента. Наибольшее число зон лизиса может быть получено с применением свежей сыворотки крови Xenopus, причем оно не увеличивается при использовании кроличьей антисыворотки. Для головастиков характерно более низкое число зон лизиса, чем для взрослых Xenopus.
Г. Методы исследования клеточного иммунитета
1. Получение культур клеток для проведения анализа
в двухвекторной смешанной культуре лимфоцитов (CKJI)
Обычно берут кровь от 12 животных и готовят суспензию лейкоцитов в среде L15 (состав см. в приложении) без СПК. При внесении клеток в лунки их концентрация в исходной суспензии составляет 5-106 клеток/мл (при использовании эппендорфовских пипеток на 20 мкл) или 3,5-106 клеток/мл (при использовании пастеровских пипеток; объем капли ~30 мкл).
504 Глава 25
В лунки V-образной формы панелей для микротитрования (Greiner М220 25AR) дозатором (Tridak) сначала вносят по 10 мкл смеси СПК и сыворотки крови Xenopus, что необходимо для уменьшения фонового связывания (1 объем СПК проверенной партии и 1 объем сыворотки крови Xenopus в разведении 1:20), а затем клетки (из расчета три повтора на точку). В лунки с аутологичными контролями вносят по 2 капли (2x20 мкл) суспензии клеток каждого типа, а в остальные, предназначенные для смешанной культуры — по одной капле суспензии (20 мкл) клеток двух типов. Обычно готовят два комплекта панелей, для того чтобы регистрировать данные в разные дни.
Через 3, 4 и 5 дней культивирования в каждую лунку вносят 1—2 мкКи 3Н-тимидина (удельная активность 2 Ки/ммоль) на 18 ч. Затем клетки отбирают с помощью многоканального хар-вестера и после обработки солуеном (Packard) определяют радиоактивность в сдинтиллядионном счетчике.
Средние значения радиоактивности используют для вычисления индексов стимуляции (ИС):
