Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
К = 2,3 lg (P0!P)~dlt,
где Р — число бляшек, выявленных в момент времени t; Pq — число бляшек в момент времени 0, т. е. число бляшек в пробе с буферным раствором; d— степень разведения (500 для разведения 1/500). Значение эффективности инактивации получают, исходя из предположения, что инактивация идет по кинетике реакции первого порядка и что равновесие реакции еще не достигнуто. Некоторые амфибии синтезируют низкоаффинные антитела, и в этом случае возникают трудности при определении величин К, поскольку кривые инактивации для таких антител нелинейны и выходят на плато (т. е. реакция достигает равновесия до того, как инактивация составит 90%) (рис. 25-8). Когда для определения относительной аффинности антител используют метод торможения инактивации (Haimovich, Du Pasquier, 1973), очень важно работать с разведением
32*
500 Глава 25
Рис. 25-8. Оценка относительного сродства антител Xenopus по данным ингибирования инактивации бактериофага (ДНФ-Т4), модифицированного ДНФ-лизином (светлые кружки), ТНФ-лизином (темные кружки) и ПНФ-лизином (светлые треугольники). А. Антисыворотка взрослых Xenopus к ДНФ, конечное разведение 1 :600 (содержит специфические антитела к ДНФ). Б. Антисыворотка взрослых Xenopus к ДНФ, конечное разведение 1 : 1650 (перекрестно-реагирующие антитела): хотя антисыворотку получали к ДНФ, она обладает высоким сродством к ТНФ-лизину. В. Антисыворотка взрослых Xenopus, конечное разведение 1 : 18 (антитела с низким сродством). Г. Перитонеальная жидкость головастика Xenopus, иммунизированного ДНФ, конечное разведение 1 : 30 (содержит специфические антитела к ДНФ).
антител еще в линейной части кривой. Оптимально проводить тестирование при 90%-ной инактивации, однако в случае антител с низкой аффинностью более предпочтительной является 70%-ная или даже 60%-ная инактивация, но при этом необходимо оставаться в пределах линейного участка кривой. Из-за низкой аффинности ряда антител некоторые сыворотки нельзя использовать для достоверной оценки относительных аффинностей.
Примеры измерений относительной аффинности антител и интерпретации соответствующих результатов приведены на рис. 25-8 и 25-9.
Б. Выявление антител после изоэлектрофокусирования
Мы предпочитаем использовать метод, в котором антитела выявляют по лизису нагруженных антигеном эритроцитов в присутствии комплемента. Гели для изоэлектрофокусирования (ИЭФ) готовят, как описано Брауном и др. (Braun et al., 1979),
Изучение иммунной системы Xenopus
501
Рис; 25-9. Определение инактивации бактериофага (в процентах) и относительного сродства антител по кривым инактивации. Выявляют разведение сыворотки, дающее 90%-ную инактивацию (например, ] : 85, А). В тесте ингибирования используют именно это разведение. В отсутствие ингибитора это разведение является контролем уровня инактивации, который в тесте ингибирования принимают за 100%. Этот участок кривой строят отдельно на оси длиной 10 см (?); значения (т. е. число бляшек), получаемые в присутствии различных концентраций ингибитора, находят на кривой и графически определяют процент ингибирования. В первом калибровочном эксперименте при разведении сыворотки 1 :85 величина рв/р составила 320/32, а во втором 270/43 (расхождение из-за экспериментальных неточностей). В качестве опорного при тестах ингибирования использовали второе значение. В присутствии концентраций ДНФ-лизина 10~6, 10-5 М и т. д. наблюдали соответственно 39 бляшек (0% ингибирования), 130 бляшек (60% ингибирования) и т. д.
применяя амфолины pH 5—8 (LKB) с добавлением мочевины (состав см. в приложении). Полимеризацию геля вызывают рибофлавином и УФ-облучением или персульфатом аммония. Используют тот способ полимеризации, при котором вероятны минимальные искажения градиента pH. После ИЭФ измеряют градиент pH с помощью поверхностного электрода с плоским торцем. Для удаления амфолинов, которые могут вызвать лизис эритроцитов на последующих стадиях, необходима трехкратная отмывка гелей по 7 мин в 0,9%-ном NaCl. Это не приводит к вымыванию слишком большого количества антител, поскольку в полиакриламидных гелях крупные молекулы диффундируют медленно. Пока гели отмываются, расплавляют 1,5%-ный раствор агарозы А37 (Indubiose) в ЗФР и доводят его температуру до 55 °С. Клетки-мишени (эритроциты) промывают и держат при комнатной температуре. Непосредственно перед использованием в небольшую эрленмейеровскую колбу
502 Глава 25
;наливают 15 мл агара, а затем 0,15 мл осадка эритроцитов, подогретого до 55°С (30 с), и осторожно (чтобы не появлялись пузырьки), но тщательно смешивают клетки с агаром. Смесь быстро наслаивают на поверхность геля, которая должна быть свободна от солевого раствора, применявшегося при отмывке. Чтобы получить хороший слой агара, нужно наносить его быстро и равномерно. Если в слое видны отдельные пузырьки, то их можно удалить кончиком пальца. Если образовались комки эритроцитов (слишком горячая смесь, недостаточное предварительное прогревание эритроцитов, плохое состояние клеток и т. п.), их можно осторожно удалить струей воды и после этого нанести новый слой.
