Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
ис= АВ/(А + В) а
За 5 дней культивирования в среде L15 число жизнеспособных клеток снижается от 100 до 45%. Однако в опытах со средами, обеспечивающими высокие уровни включения метки, наибольшие индексы стимуляции наблюдаются далеко не всегда. Часто лучшие результаты получали со средой Вольфа и Куим-би, чем со средой L15. В среде без СПК, но с добавлением глюкозы (до конечной концентрации 0,5% по объему) также регистрировали низкий фон (что устраняло необходимость обработки лунок сывороткой крови Xenopus) и высокие ИС.
Культивирование в средах на бикарбонатной буферной основе при 26—28 °С в С02-инкубаторе дает удовлетворительные результаты при условии, что для используемой концентрации бикарбоната содержание СОг не превышает 5%. При добавлении в среду в качестве индикатора фенолового красного она должна иметь бледно-оранжевый, а не желтый цвет.
2. Однонаправленная реакция в СКЛ
Клетки одного из партнеров лишают способности к пролиферации облучением (3000 Р). Перед культивированием облученные клетки необходимо дважды промыть, так как в противном случае будет низкой жизнеспособность всех клеток культуры. Клетки селезенки дают хорошие результаты при
Изучение иммунной системы Xenopus
505
использовании их в качестве как стимулирующих, так и отвечающих партнеров. Лимфоциты периферической крови дают хорошие ответы в однонаправленной реакции в СКЛ, но имеют низкую стимулирующую активность. Иногда при заборе крови у небольших животных не удается получить достаточного для реакции в СКЛ числа лимфоцитов. В этом случае, не забивая животных, у них удаляют тимусы и используют тимоциты.
3. Клеточно-опосредованная цитотоксичность
а. Индукция цитотоксической реактивности. До -сих пор в первичных смешанных культурах лимфоцитов не удавалось индуцировать цитотоксические лимфоциты (ЦТЛ). Поэтому использовали следующий прием. Лягушек определенного генотипа МНС иммунизировали, вводя им внутривенно два или большее число раз по 3—5-106 облученных лимфоцитов от несовместимых по МНС доноров с интервалом между инъекциями 4—5 нед. Альтернативным вариантом является трансплантация кожи от несовместимых по МНС доноров. Через 3—5 нед после последней инъекции или через 3—4 нед после отторжения трансплантата из животных выделяли селезенки и готовили клеточные суспензии спленоцитов. Стимулирование реакции в СКЛ проводили, культивируя примированные клетки селезенки (4—5-106) с облученными рентгеновскими лучами (3000 Р; на аппарате RT 300S Phillips при токе 10 мА через медный фильтр 2,7, интенсивность облучения 100 Р/мин) стимулирующими клетками (1—6-106) в 2 мл среды L15 с 10%, СПК. Клетки культивировали в лунках панелей (Costar, № 3524) при 27^С 4 сут.
б. Приготовление клеток-мишеней. Стимулированные ФГА бласты получают инкубацией жизнеспособных клеток селезенки (5-106) в присутствии 50 мкг ФГА-Р (Difco) в 1 мл среды L15. СПК (0,1 мл) добавляют в среду через 12—16 ч, чтобы избежать ее конкуренции с ФГА за связывание с клетками. Через пять дней клетки-мишени осаждают центрифугированием, промывают в среде L15, ресуспендируют в 100— 300 мкл Na251Cr04 (500—1000 мкКи/мг, 10мкКи/мл) и инкубируют 2 ч при 27 °С при частом встряхивании. После инкубации клетки ресуспендируют в 5 мл среды L15, наслаивают на 3 мл смеси фиколла (Pharmacia, Швеция) и уровизона (Shering, Западный Берлин) (плотность смеси 1,076) и центрифугируют при 350 g 7 мин. Клетки на границе фаз собирают и три раза промывают в 10 мл среды L15. Фракция этих клеток содержит большую долю (20—40%) лимфобластов. После подсчета клеток их концентрацию доводят до таких значений, чтобы добав-
506 Глава 25
лять по 2-104 клеток-мишеней в каждую лунку при постановке теста на цитотоксичность.
в. Подготовка клеток-киллеров. После завершения процедуры рестимуляции in vitro отвечающие клетки промывают и ресуспендируют таким образом, чтобы их максимальная концентрация в цитотоксическом тесте в момент внесения в культуру соответствовала значению 1—1,2-107. Исходя из этой концентрации, готовят серийные трехкратные разведения.
г. Цитотоксический тест с сенсибилизированными лимфоидными клетками. Этот тест проводят в круглодонных лунках микротитрационных панелей (Greiner, М220 24 AR) по методике Набхольца и др. (Nabholz et al., 1974). Клетки-киллеры и клетки-мишени вносят в каждую лунку в конечном объеме 200 мкл. Для определения уровня спонтанного освобождения slCr в некоторые лунки вносят только клетки-мишени (2-104 клеток в 200 мкл). Панели центрифугируют при 25g 2 мин и затем инкубируют 7 ч при 27 °С во влажной атмосфере в СОг-инкубаторе (5% СОг).
Каждую популяцию отвечающих клеток исследуют в трех повторах при каждом разведении на различных клетках-мишенях. После инкубации панели центрифугируют 5 мин при 1000 g, из лунок отбирают по 100 мкл супернатанта, переносят эти аликвоты в маленькие пластмассовые пробирки и измеряют радиоактивность на сцинтилляционном гамма-счетчике. Процент специфического освобождения 51Сг рассчитывают по формуле
jqq % освобождения в эксперименте — % спонтанного освобождения 100 — % спонтанного освобождения
