Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
Е. Пересадка кожи (Bernardini et al., 1969)
1. Подготовка донорской кожи
Животное-донора наркотизируют в растворе MS222 и вырезают у него на животе участок кожи, размер которого определяется числом пересадок при среднем размере трансплантата
IE—1278
482 Глава 25
7
3X3 мм. При работе с донорской кожей следует избегать ее повреждений пинцетом, так как в противном случае на трансплантате могут образоваться очаги так называемой неспецифической аутодеструкции. Кожу переносят на предметное стекло в каплю холодного ЗФР и расправляют. Предметное стекло помещают на миллиметровую бумагу и кусочки кожи нарезают скальпелем на фрагменты нужного размера.
2. Манипуляции с животным-хозяином
На коже спины наркотизированного животного делают разрез длиной 4—5 мм и немедленно вставляют в него трансплантат так, чтобы края разреза сошлись над пересаженной кожей. Это облегчает доступ к трансплантату через 48 ч, когда кожу хозяина срезают, чтобы обнажить белую кожу донора. К этому моменту трансплантированная кожа должна прочно прирасти. Наблюдение за состоянием трансплантата можно проводить без анестезии. Васкуляризация трансплантата обычно происходит через 3—5 дней после пересадки.
IV. ПОДГОТОВКА ЛИМФОЦИТОВ ДЛЯ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР
А. Клетки крови
Кровь получают в присутствии гепарина. Если у животных кровь берут часто, то у них развивается тенденция к более быстрому ее свертыванию. В таких случаях концентрацию гепарина можно поднять до 20 ед./мл крови, тогда как в других случаях достаточно 10 ед./мл. Примерно 1—2 мл крови разводят в б мл или ЗФР для амфибий (65% ЗФР для млекопитающих + 35% воды), или культуральной среды и наслаивают на 2 мл фиколла (плотность 1,080) в пробирке на 12 мл. Если необходимо обработать большие объемы крови, то лучше разлить ее в несколько пробирок.
После центрифугирования в течение 10 мин при 200 g на границе фаз формируется белый слой. Кровь животных, подвергавшихся повторным кровопусканиям, как правило, содержит много эритробластов, которые при центрифугировании не достигают осадка эритроцитов, а остаются в слое фиколла, что затрудняет получение чистого препарата лейкоцитов. Лейкоциты промывают 2—3 раза, осаждая их центрифугированием, и подсчитывают. В тех немногочисленных случаях, когда тромбоциты сохраняют типичную для них вытянутую форму, их удается легко отличить от лейкоцитов, всегда имеющих более или менее округлые очертания. Чаще, однако, тромбоциты имеют
Изучение иммунной системы Xenopus
483
\
овальную или круглую форму и их трудно отличить от лейкоцитов, что может приводить к ошибкам в подсчетах. В этих случаях следует выдерживать гемоцитометр в течение примерно 4 мин при комнатной температуре, для того чтобы тромбоциты прикрепились к стеклу. После этого в фазово-контрастном поле они напоминают «глазки яичницы» сероватого цвета (рис. 25-7). Круглые неприкрепившиеся клетки можно считать как лейкоциты. Соотношение числа тромбоцитов и лейкоцитов может варьировать от 1:1 до 5: 1. Эозинофилы Xenopus крупные, бледно-оранжевого цвета, по виду напоминают ягоды ежевики, так как содержат очень крупные гранулы, характерные для эозинофилов амфибий. Выход лейкоцитов на 1 мл крови варьирует в пределах 1,5-106—З-Ю6. Эритроциты, присутствующие в количестве -~3—4-10® клеток/мл видны очень хорошо (рис. 25-5). Разделение с помощью фиколла обычно приводит к относительному обогащению фракции лейкоцитами: от 1 лейкоцита на 300 эритроцитов до 10 лейкоцитов на 1 эритроцит, т. е. в 3000 раз. Для культивирования клеток амфибий используют различные среды. Пригодны все среды, имеющие осмоляр-ность, оптимальную для клеток лягушек (242 мосм/°С). Для этих целей с успехом используют среды RPMI, L15, МСИД и МСИДИ с добавлением 1—10% СПК (состав среды L15 см. в приложении). Можно применять бессывороточные среды, если добавлять в них глюкозу до конечной концентрации 0,5— 1 мг/мл (вес/объем), что обеспечивает поддержание культуры в течение времени, необходимого для проведения реакции в смешанной культуре лейкоцитов, для митогенной стимуляции клеток ФГА или для краткосрочной продукции антител in vitro (10 дней).
Колебания концентрации клеток от 2,5-106 до 5-106 в 1 мл среды не имеют принципиального значения.
Б. Суспензии клеток тимуса или селезенки
У наркотизированного животного удаляют соответствующий орган и помещают его в маленькую чашку Петри с ЗФР. При работе с селезенкой рекомендуется добавлять в ЗФР гепарин до 10 ед./мл, для того чтобы избежать образования большого числа сгустков в этом наполненном кровью органе.
Выделенные органы можно измельчать пинцетом, однако лучше сжимать и растирать их краями двух стерильных предметных стекол. При этом наилучших результатов достигают в том случае, когда поверхность покровных стекол смачивают ЗФР, поступающим из чашки Петри благодаря капиллярному эффекту.
31*
Рис. 2Б-7. Подсчет лейкоцитов в крови. А. Нулевой момент времени. Б. Через 4 мин Преломляющие свет, окруженные ореолом клетки можно подсчитывать как лейкоциты, используя гемоцитометр Нойбауэра. В. Эритроциты.
