Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
V. ХАРАКТЕРИСТИКА КОСМИДНЫХ КЛОНОВ
А. Выделение ДНК
Приведенная ниже пропись представляет собой несколько модифицированную методику, описанную Бирнбоймом (Birn-boim, 1983). 400 мл бульона L-амп в двухлитровой колбе засевают свежей одиночной колонией или же бактериями, соскобленными из замороженного хранящегося материала. Колбу закрывают стерильной алюминиевой фольгой (не ватной пробкой) и инкубируют на качалке в течение ночи при 37 °С и при 300 об/мин. Клеточную суспензию центрифугируют в полипропиленовых центрифужных стаканах объемом 400 мл (ротор GS3 Sorvall 6000 об/мин, 10 мин, 4°С). Осадки ресуспендируют в ледяном ТНЭ-буфере (40 мл), суспензию переносят в пробирки на 50 мл (Falcon, № 2070) и центрифугируют (Minifuge, Не-raeus, 6000 об/мин, 10 мин, 4°С). Осадки ресуспендируют в 5 мл раствора для щелочного лизиса А, ставят в лед и добавляют 10 мл раствора для щелочного лизиса Б. Аккуратно перемешивают содержимое пробирок переворачиванием и оставляют их во льду на 15 мин. Добавляют 7,5 мл 5 М ацетата калия, pH 6, аккуратно перемешивают и оставляют во льду еще на 15 мин. Лизированные клетки переносят в поликарбо-натные стаканы с алюминиевыми крышками (Beckman) и осаждают хромосомную ДНК центрифугированием в роторе Ti 60 (Beckman) при 30 000 об/мин в течение 30 мин при 4°С. Надо-садочную жидкость переносят в чистые пробирки на 50 мл (Falcon), добавляют 10 мл фенола, перемешивают на вортексе и добавляют 10 мл севага. Вновь перемешивают на вортексе и разделяют фазы с помощью центрифугирования (6000 об/мин, 10 мин, комнатная температура). Водную фазу переносят в полипропиленовую пробирку на 50 мл (Sorvall, № 00246), добавляют 16 мл изопропилового спирта, перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 2 мин. Нуклеиновые кислоты осаждают с помощью центрифугирования (Sorvall, 15 000 об/мин, 30 мин, 4°С). Осадок растворяют в 1 мл ТЭ-буфера, добавляют 10 мкл РНКазы А (10 мг/мл) и диализуют в течение ночи против 2 л ТЭ-буфера. В таком виде космидная ДНК готова для
Методы, применяемые в молекулярной иммунологии
33
рестрикционного картирования. Небольшое загрязнение хромосомной ДНК Е. coli обычно не представляет собой проблемы; однако для получения зондов, используемых в опытах по «прогулке вдоль хромосомы» (см. ниже), мы дополнительно очищаем космидную ДНК с помощью центрифугирования в CsCl (Maniatis et al., 1982).
Б. Анализ методом дот-блот
Если скрининг космидной библиотеки проводили с использованием нескольких зондов, то соответствие между разными космидными клонами можно установить с помощью простого метода гибридизации дот-блот (Kafatos et al., 1979). К 2 мкл каждой из космидных ДНК добавляют 170 мкл 100 мМ трис-НС1, pH 7,4, 30 мкл 2 М NaOH и 100 мкл 20XSSC. Смеси прогревают при 80 °С в течение 10 мин для денатурации ДНК и нейтрализуют добавлением 40 мкл 2 М трис-HCl. Каждую пробу разделяют на порции, число которых равно числу использованных для гибридизации зондов, и наносят образцы на нитро-целлюлозный фильтр с использованием фильтрационного устройства (например, Minifold, Schleicher, Schiill). Фильтр разрезают таким образом, чтобы каждая полоска содержала набор точек, соответствующих всему набору космидных клонов. Далее каждую полоску гибридизуют индивидуально с одним гибридизационным зондом.
В. Рестрикционное картирование
Для получения рестрикционной карты космидного клона рестриктазы выбирают таким образом, чтобы нуклеотидная последовательность, которую они узнают, содержала один или два динуклеотида CpG (например, Sail, Clal, Smal, SocII, Xhol, Mlul, Nrul, BssHll). Поскольку в эукариотических ДНК дину-клеотиды CpG встречаются довольно редко, в большинстве случаев эти ферменты будут узнавать лишь ограниченное число сайтов во вставке, и поэтому ими легко пользоваться для картирования. Наряду с этим используют также некоторые ферменты, разрезающие ДНК в большем числе мест (например, Kpnl, Hpal, EcoRl, BamHl, Mill), Следует проверить, что космидный вектор картируется с помощью имеющихся ферментов рестрикции.
Если с использованием однокопийного зонда выделено несколько космидных клонов и они, вероятно, перекрываются друг с другом, то их можно быстро совместить, используя приведенную ниже методику (пропись для вектора pNNL) (см. карту на рис. 1-1; для других космидных векторов могут потребоваться другие наборы ферментов). 0,25 мкг каждой из клонированных ДНК гидролизуют ферментами Sail, Clal, Kpnl, Smal»
3—1278
34 Глава I
Mlul, Nrul, Kpn\-\-Mlul и Kpnl-\-Nrul. Гидролизаты анализируют в 0,6%-ном агарозном геле в ТАЭ-буфере (Maniatis et al.,
1982) с использованием маркерных фрагментов, полученных из ДНК фага К. Маркерные фрагменты наносят на две крайние и на среднюю дорожки геля. Поскольку почти во всех случаях во вставке эукариотической ДНК отсутствуют последовательности, узнаваемые рестриктазами Mlul и Nrul (следует проверить гидролизаты, полученные с помощью каждого из ферментов Nrul и Mlul), сравнение гидролизатов Крп\ и Kpnl+Mlul позволяет идентифицировать /Сря1-фрагмент, который расположен между K/mI-сайтами в векторной ДНК, переходит во вставку и перекрывает участок вектора, содержащий 2 сайта рестрикции Mlul (см. карту на рис. 1-1). Точно так же фрагмент Kpnl, расположенный в векторе в противоположном направлении от K/mI-сайта, может быть идентифицирован путем сравнения гидролизатов, полученных с помощью Kpnl и Kpnl-\-Nrul. Этот фрагмент расщепляется рестриктазой Nrul и не расщепляется рестриктазой Mlul (см. карту на рис. 1-1). Все остальные фрагменты Kpnl, таким образом, происходят исключительно из вставки эукариотической ДНК, и с помощью рестриктаз Sg/I, Clal и Smal можно получить характерный для каждого из клонов набор фрагментов. После того как все клоны картированы и ориентированы относительно друг друга, становится ясно, что два клона, которые занимают крайнее левое и крайнее правое положения, картируются всеми ферментами с использованием метода одиночных и двойных гидролизатов (Maniatis et al.,
