Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
I МНС, были идентифицированы путем введения их в Ltkr-клетки с последующим исследованием Ь^--трансформантов с помощью антисывороток соответствующей специфичности (Goo-denow et al., 1982). В настоящее время можно также выделять гены, продукты которых находятся на плазматической мембране; это достигается с помощью комбинации метода переноса генов и клеточного сортинга с применением флуоресцентных зондов (Kavathas, Herzenberg, 1983). Вопросы, касающиеся иммунного надзора, механизма антигенного представления и токсичности тяжелых цепей, также исследуются в последнее время с помощью метода переноса генов. Наконец, имеются доказательства, что последовательности, определенные с помощью молекулярных методов, такие, например, как последовательности, опубликованные для рецептора Т-лимфоцитов (Yanagi
Трансформация лимфоидных клеток с помощью ДНК
39
et al., 1984; Hedrick et al., 1984), также могут быть получены с использованием метода переноса генов и соответствующих биологических тестов.
К сожалению, стабильный перенос гена представляет собой относительно малоэффективный процесс. Наибольшая частота стабильного переноса генов наблюдается для линии фиброблас-тов NIH-3T3 и Ltkr (стабильная трансформация встречается с частотой одна на 103 клеток). Для лимфоидных клеток наблюдаются гораздо более низкие частоты стабильного переноса генов (от одной на 105 до одной на 108). Естественно, что для изучения трансформированных клеток необходимо удалить огромный избыток нетрансформированных. Это достигается с помощью введения в клетки наряду с изучаемым геном доминантного селектируемого маркера.
II. ДОМИНАНТНЫЕ СЕЛЕКТИРУЕМЫЕ МАРКЕРЫ
Как показал Виглер, при введении гена тимидинкиназы вируса простого герпеса (HSV-tk) в Ь/й_-клетки и применении селективного давления (среда ГАТ) появляются стабильные трансформанты, которые наследуют ген HSV-tk (Wigler et al., 1977). Следовательно, при добавлении среды ГАТ нетрансфор-мированные клетки элиминируются, и благодаря этому можно получать чистую популяцию трансформированных клеток. Другими доминантными селектируемыми генами являются ген резистентности к неомицину (пеот) и ген резистентности к мико-феноловой кислоте (gpt).
Селективную среду ГАТ используют и в системе фибро-бластов, поскольку эффективность переноса гена в эти клетки довольно высока, а частота спонтанной реверсии для линии Ltkr очень низка (<10-7). В практическом плане существенным является вопрос о доступности агента, применяемого для селекции. Среда ГАТ хороша тем, что она недорого стоит и ее легко приготовить. Многочисленные линии В- и Т-лимфоцитов, адаптированные для гибридомной техники, обладают фенотипом tkr, поэтому данную систему селекции в принципе можно применять и для этих клеточных линий. Однако частота стабильного переноса генов в лимфоидные клетки нередко очень близка к частоте спонтанной реверсии для многих из этих клеточных линий.
Маллиган и Берг (Mulligan, Berg, 1981) показали, что ген бактериальной ксантин — гуанин-фосфорибозилтрансферазы (часто называемый геном gpt) в комбинации с эукариотическими последовательностями, контролирующими транскрипцию, может функционировать в эукариотических клетках, придавая этим клеткам устойчивость к такому антибиотику, как мико-
40 Глава 2
феноловая кислота. К тому же, поскольку этот ген является прокариотическим, клетки эукариот не могут приобретать спонтанную резистентность и этот ген можно переносить в любую клеточную линию, иными словами, не требуется наличия в трансформируемых клетках генетической мутации. Поскольку фермент gpt в пути биосинтеза находится после гипоксантин-фосфорибозилтрансферазы (ГФРТ), соответствующий ген можно переносить в многочисленные линии миелом, тимом и макрофагов, обладающих фенотипом ГФРТ-; при этом будет происходить синтез GMP, компенсирующий мутацию ГФРТ-.
Колберт-Гарапин и др. (Colbert-Garapin et al., 1981), а также Саузерн и Берг (Southern, Berg, 1982) показали, что при присоединении к гену бактериальной фосфотрансферазы
АРН(3')П (пеот) генетических элементов, контролирующих транскрипцию, можно после введения соответствующего гена в эукариотические клетки передавать устойчивость к аминогли-козидному антибиотику G-418. Антибиотик G-418 по структуре сходен с неомицином, и ген, придающий резистентность к G-418, часто называют пеот. Поскольку пеот является прокариотическим геном (он содержится в транспозонах Тп5 и ТпбО), эукариотические клетки не могут приобретать спонтанную резистентность к антибиотику. Вместе с тем этот ген можно вводить в любую из клеточных линий, так же как и в случае селективной системы на основе гена gpt и микофеноловой кислоты.
III. МЕТОДЫ СТАБИЛЬНОГО ПЕРЕНОСА ГЕНОВ
А. Копреципитация ДНК с фосфатом кальция
Эта методика, исходно описанная Грехэмом и ван дер Эбом (Graham, van der Eb, 1973), схематически представлена на рис. 2-1, а ее краткое описание приведено ниже.
1. Ген, представляющий интерес (неселектируемая ДНК, 1—10 мкг), смешивают с ДНК доминантного селектируемого маркера (0,01—0,1 мкг) и окончательное содержание ДНК в пробе доводят до 10—20 мкг путем добавления ДНК-носителя, не содержащей последовательностей, гомологичных изучаемому гену или доминантному селектируемому маркеру (обычно это ДНК тимуса теленка или ДНК клеток Ltkr). Количества ДНК приведены для одного опыта по трансформации.
