Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Лефковитса И. -> "Иммунологические методы исследований" -> 11

Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.

Лефковитса И., Перниса Б. Иммунологические методы исследований — М.: Мир, 1988. — 530 c.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка): immunologicheskiemetodi1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 5 6 7 8 9 10 < 11 > 12 13 14 15 16 17 .. 239 >> Следующая

30 Глава 1
радиоавтографии применяют пленку Kodak X-Omat R. Экспозицию проводят в течение ночи при —70 °С с использованием усиливающих экранов (например, Ilford, быстрый вольфрамат-ный). На кассете отмечают дату проявления.
Перед проявлением кассетам дают возможность прогреться до комнатной температуры, удаляют усиливающий экран и пленку и закрывают кассету, чтобы избежать какого бы то ни было движения фильтров на бумаге Whatman 3 ММ. После идентификации положительных колоний (см. ниже) фильтры хранят при —70 °С в картонной коробке, а для дальнейшей работы используют проявленную пленку (разд. IV, Б).
Д. Идентификация и ofcee положительных колоний
Для того чтобы идентифицировать положительные сигналы, после того как фильтр совмещен с бумагой 3 ММ в соответствии с метками, нанесенными радиоактивными чернилами (используют просвечивающий осветитель), маркирующие точки с фильтра переносят на пленку. Положительные гибридизацион-ные сигналы должны присутствовать на обеих репликах, полученных с одного и того же исходного фильтра, что позволяет легко отличить их от ложных радиоактивных сигналов, обусловленных фоновой гибридизацией. Положительные сигналы обозначают соответствующим номером клона.
Для отсева положительных колоний из морозильника достают чашки со средой HMF-2 амп, содержащие фильтры с замороженными бактериями. Им дают возможность оттаять при комнатной температуре в течение 30 мин, после чего фильтры вынимают и вносят в чашки со свежей средой L-амп. Если фильтры слишком влажные, их подсушивают в течение короткого времени на бумаге Whatman 3 ММ. Бактериям дают возможность восстановить свою жизнеспособность с помощью инкубации их в чашках при комнатной температуре в течение ~2 ч. Пленку для радиоавтографии помещают на световой ящик и закрывают ее пленкой Saran, на которую кладут фильтр, содержащий живые колонии. Фильтр и пленку совмещают с помощью маркирующих отверстий. Область над положительным сигналом соскабливают стерильной зубочисткой и суспендируют бактерии в 500 мкл бульона L-амп. Фильтр кладут в чашку со средой HMF-2 амп и оставляют ее при комнатной температуре еще на
2 ч. Затем фильтры замораживают, как описано в разд. III, И. По нашему опыту мы знаем, что замороженные бактерии выдерживают около 10 циклов замораживания и оттаивания. Если их жизнеспособность уменьшается, то из замороженного сэндвича можно получить новый фильтр-реплику (разд. III,И).
Методы, применяемые в молекулярной иммунологии
31
Е. Повторный скрининг положительных колоний
Снятые с фильтра и ресуспендированные бактерии разводят и вновь высевают для повторного скрининга. Последний проводят на нитроцеллюлозных фильтрах (Millipore, номер по каталогу 13750) для получения одиночных положительных колоний с помощью гибридизационного зонда. Фильтры Millipore помещают в чашки Петри со средой L-амп (Falcon, № 1058, диаметр 15 см); число чашек должно соответствовать числу положительных колоний в исходном скрининге.
Из каждой клеточной суспензии делают разведения 10-2, 10_3 и 10-4 на среде L-амп (по 1 мл каждого). По 200 мкл каждого разведения наносят на '/з площади фильтра (Grosveld et al., 1981), начиная с низшего. Дают возможность среде впитаться в агар, после чего инкубируют чашки агаром вверх в течение ночи. Минимальное разведение должно дать несколько колоний, хорошо отделенных друг от друга. На следующий день готовят один набор фильтров-реплик по прописи, приведенной в разд. III, И, также с использованием фильтров Millipore. При повторном скрининге обычно нет необходимости готовить второй набор фильтров для гибридизации. После подрастания реплицированных бактерий (обычно около 6 ч при 37 °С) клетки лизируют на фильтрах-репликах, которые далее проводят через этапы денатурации и связывания ДНК, как описано в разд. III, К. Исходные фильтры хранят при 4 °С и используют для последующего отбора положительных колоний.
Фильтры инкубируют в большой стеклянной чашке Петри, покрытой стеклянной пластинкой, как описано ранее (разд. IV, А). Для гибридизации используют супернатант от исходного скрининга (разд. IV, Б), который прогревают 10— 15 мин при 70 °С для денатурации ДНК и охлаждают в смеси воды и льда. После гибридизации фильтры отмывают, экспонируют и отбирают на них одиночную, находящуюся на достаточном расстоянии от других положительную колонию (разд. IV, В—Д). Положительный клон высевают штрихом в свежую чашку с агаром L-амп и подготавливают ночную культуру для выделения ДНК в среде L-амп.
Ж. Хранение космидных клонов
1 мл ночной культуры вносят в стерильный пластиковый флакон, содержащий 70 мкл ДМСО. Флакон закрывают крышкой, его содержимое перемешивают на вортексе, быстро замораживают в жидком азоте и хранят при —70 °С. Для отбора бактерий соскабливают некоторое количество клеток из замороженной суспензии, не подвергая оттаиванию основной материал,
32 Глава I
и выращивают их. Во избежание непредвиденных случайностей клонированную ДНК сохраняют. В случае, если клетки теряются или утрачивают жизнеспособность, ДНК можно разрезать по уникальному рестрикционному сайту в векторе или во вставке, лигировать ее саму на себя и вновь подвергнуть упаковке in vitro. Такую клонированную космидную ДНК можно вводить в клетки-хозяева Е. coli 490А.
Предыдущая << 1 .. 5 6 7 8 9 10 < 11 > 12 13 14 15 16 17 .. 239 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed