Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
1982). Для построения рестрикционных карт на основе этого метода разработаны компьютерные программы (Pearson, 1982; Durand, Bregegere, 1984).
Г. Выделение зондов для «прогулки вдоль хромосомы»
С целью выделения специфического зонда для «прогулки вдоль хромосомы» идентифицируют рестрикционный фрагмент, находящийся на конце вставки эукариотической ДНК. Такой фрагмент не должен содержать повторяющихся последовательностей ДНК- Это легко проверить путем гибридизации с суммарной ДНК мыши, используемой в качестве зонда для гибридизации по Саузерну. Этот зонд содержит космидную ДНК, гидролизованную различными ферментами (использованными для картирования). В нормальных условиях будут гибридизоваться лишь те рестрикционные фрагменты, которые содержат повторяющиеся последовательности ДНК (Steinmetz et al., 1980). Фрагменты, которые не гибридизуются и которые происходят из концевых областей вставки эукариотической ДНК, далее выделяют с помощью электрофореза в агарозном геле, используя один из многочисленных имеющихся методов (Maniatis et al.,
Методы, применяемые в молекулярной иммунологии
35
1982; Dretzen et al., 1981). Методика, которую мы применяем в настоящее время, включает следующие этапы: 50 мкг клонированной ДНК гидролизуют с соответствующими ферментами, фрагменты разделяют в геле легкоплавкой агарозы (Bio-Rad, номер по каталогу 162—0020) и вырезают из геля нужный фрагмент. Для выделения и очистки ДНК кусочек агарозного геля плавят в 15 мл буфера с низкой ионной силой (0,2 М NaCl, 20 мМ трис-НС1 pH 7,5, 1 мМ ЭДТА), нагревая его до 68°С и инкубируя 30 мин. Затем раствор охлаждают до 37 °С (длительность инкубации 15 мин) и ДНК очищают с помощью хроматографии на Elutip-d (Schleicher, Schiill; по прописи изготовителя со следующими модификациями: перед осаждением ДНК этанолом буфер с низкой ионной силой подогревают до 37 °С и добавляют 10 мкг тРНК).
Выделенные фрагменты ДНК проверяют с помощью гибридизации с геномным саузерн-блотом. Гибридизацию проводят в присутствии немеченой эукариотической ДНК (50 мкг/мл), которая является конкурентом по отношению к примесным повторяющимся последовательностям ДНК. присутствующим в зонде (разд. IV, Б). Далее, для того чтобы оценить чистоту зонда и подтвердить его локализацию на карте, проводят гибридизацию с блотом, содержащим рестрикционные фрагменты космидного клона. Фильтр, на котором идентифицировали малокопий-ные последовательности, может быть использован повторно, после того как меченую ДНК мыши отмыли в процессе двух 15-минутных инкубаций в растворе 0.1XSSC, 0,1%-ного ДСН при 90 °С. Выделенный фрагмент можно использовать для скрининга космидной библиотеки лишь в том случае, если оба эксперимента, включающие блот-гибридизацию по Саузерну, дают удовлетворительные результаты (нуклеотидная последовательность должна быть однокопийная и достаточно свободная от примесных рестрикционных фрагментов).
VI. КРИТИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА
Поскольку космидные векторы могут нести вставки, длина которых примерно вдвое превышает длину вставок, клонируемых в бактериофаге К, опыты типа «прогулки вдоль хромосомы» дают более эффективные результаты в системах клонирования на основе космид. До последнего времени для выделения и характеристики эукариотических генных участков широко использовалась система на основе бактериофага “к (Eickbush, Ка-fatos, 1982; Shimizu et al., 1982; Bender et al., 1983; Pirotta et al.,
1983).
Целесообразно проверять данные опытов по «прогулке вдоль хромосомы», сравнивая изолированные космидные клоны и геномные ДНК с помощью блот-гибридизации по Саузерну.
3*
36 Глава I
Это легко выполнимо для клонов, выделенных из МНС ДНК мыши при использовании большого числа конгенных и рекомбинантных конгенных линий мыши (Klein et al., 1983). Выделенный из клона однокопийный зонд, используемый для «прогулки вдоль хромосомы», применим также для выявления полиморфизма по сайтам рестрикции двух инбредных линий мышей. Конгенные или конгенные рекомбинантные линии мышей, содержащие гены МНС или части этого комплекса одной линии мышей, а все другие гены — другой, могут быть подвергнуты анализу для выяснения происхождения клонированной последовательности (Steinmetz et al., 1982b).
При скрининге космидных библиотек с использованием различных зондов в ряде случаев было обнаружено, что определенные последовательности представлены недостаточно (Steinmetz et al., 1982b). Интересно, что это явление было отмечено для самых разных инбредных штаммов мышей (М. Steinmetz, неопубликованные данные). При его объяснении обсуждаются две проблемы. Во-первых, участки, узнаваемые рестриктазами Sau3A или МЬо\ (т. е. ферментами, используемыми для частичного гидролиза эукариотической ДНК), могут быть распределены не случайным образом, а так, что определенные последовательности оказываются расположенными на фрагментах ДНК, слишком крупных или слишком мелких для клонирования. Во-вторых, эффективность репликации в Е. cold эукариотических ДНК-последовательностей может снижаться из-за их модификаций. Вероятно, первую из этих проблем удалось бы решить с помощью других комбинаций ферментов при конструировании космидных библиотек. Например, возможен частичный гидролиз с помощью рестриктаз Alul или НаеIII и введения фрагментов в космидные векторы с использованием линкеров (Maniatis et al., 1982).
